【作者】王芬 朱平

【機(jī)構(gòu)】北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

【摘要】7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2是克隆自真菌香菇的兩個(gè)雙功能酶(序列一致性97%),具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶雙重活性,能特異性地水解移除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等紫杉烷上的木糖基。采用生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)酶蛋白進(jìn)行酶活性中心預(yù)測(cè),初步確定Asp300和Glu529分別為親核試劑和一般酸/堿催化劑,而Asn172-Gly173-Arg174和Lys207-His208為底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。以LXYL-P1-2為研究對(duì)象,以畢赤酵母細(xì)胞為表達(dá)宿主,應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了N172A、G173A、R174A、K207A、H208A、D300N和E529Q突變體,并進(jìn)行了酶活性分析。結(jié)果顯示:在分別以PNP-Xyl、PNP-Glc和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇為底物時(shí),N172A、G173A、R174A、K207A、D300N和E529Q的β-木糖苷酶與β-葡萄糖苷酶活性大幅度下降甚至完全消失;H208A的β-木糖苷酶活性也顯著下降,但仍保持98%的β-葡萄糖苷酶活性。其結(jié)果初步驗(yàn)證了對(duì)上述兩個(gè)酶蛋白的活性中心的預(yù)測(cè),為進(jìn)一步揭示7-木糖紫杉烷糖基水解酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 

【基金】國家自然科學(xué)基金(No.30770229； No.31270796)；

【關(guān)鍵詞】香菇; β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶; 酶活性中心預(yù)測(cè); 定點(diǎn)突變; 酶活性分析;