2023年4月28日，我國第一個基因編輯生物安全證書授予舜豐生物的基因編輯大豆，預(yù)示著基因編輯育種在我國的規(guī)范化和逐步合法化。目前雖然在多種食藥用菌中成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，但多數(shù)物種僅限于技術(shù)的可行性，靶基因多限于URA3/pyrG，少數(shù)應(yīng)用于代謝產(chǎn)物合成通路解析等，未對影響表型或性狀改良的基因進行編輯，即未能在菌種選育中得到應(yīng)用。

2022年中國科學(xué)院微生物研究所董彩虹研究員團隊在蛹蟲草中建立了無痕的CRISPR/Cas9基因編輯體系，可實現(xiàn)單、雙基因的高效無痕編輯和精準敲除，為蛹蟲草基因編輯育種奠定基礎(chǔ)（Meng et al., 2022; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35829671/），而遺傳學(xué)和育種研究中基因敲入與敲除同樣重要。

外源基因的插入往往會影響靶位點基因、側(cè)翼鄰近基因的表達以及染色質(zhì)狀態(tài)，進而對宿主產(chǎn)生不良影響。基因組安全位點（Safe harbor）為外源基因提供一個安全可靠的停泊“港口”，使得外源基因既可以穩(wěn)定高效表達，同時不會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生任何可識別的表型變化。以基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在蛹蟲草基因組中鑒定出多個安全位點，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對其進行敲除和敲入驗證，得到第一個可用的安全位點CmSH1。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種安全位點靶向的CRISPR/Cas9基因敲入系統(tǒng)，通過簡單的一步克隆連接即可構(gòu)建敲入載體，實現(xiàn)基因過表達或外源基因在安全位點的定點整合。利用該系統(tǒng)對蛹蟲草疏水蛋白基因Cmhyd1進行定點過表達，基因編輯菌株“白毛病”抗病性增強，對蛹蟲草農(nóng)藝性狀影響微弱且不影響其子實體商品性。PCR測序和基因組重測序確認Cmhyd1過表達菌株無脫靶和外源基因、序列殘留。

2023年10月，該研究結(jié)果以“Safe-Harbor-Targeted CRISPR/Cas9 System and Cmhyd1 Overexpression Enhances Disease Resistance in Cordyceps militaris”為題在Journal of Agricultural and Food Chemistry雜志在線發(fā)表。

本研究獲得了食用菌基因組中第一個安全位點，實現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因定點敲入。本研究也是無痕基因編輯獲得的第一例抗病菌株，為其他食用菌抗病育種提供借鑒，對病害的防控具有重要的科學(xué)意義和實踐價值。該研究目前已經(jīng)申請專利（專利申請?zhí)枺?/span>202211257442.5）。本工作主要由博士生研究生劉晴完成，得到國家重點研發(fā)項目（2022YFD1200602）和國家自然科學(xué)基金面上項目（31872163，32272786）的資助。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c05131