Introduction

自1987年發(fā)現(xiàn)硫酸多糖具有抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的活性以來，硫酸多糖受到了關(guān)注。硫酸多糖有廣泛的生物活性，包括抗氧化劑、抗血管生成、抗腫瘤、抗補(bǔ)體、抗炎和其他類肝素活性。多糖的生物活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)密切相關(guān)，硫酸酯化基團(tuán)具有空間位阻和靜電排斥作用，可以改變多糖的原始結(jié)構(gòu)，使糖鏈呈較伸展?fàn)顟B(tài)，提高其在水中的溶解度，也會(huì)進(jìn)一步改善其生物活性。比如，一種來自木層孔菌的β-葡聚糖(PRP)的兩種硫酸酯化衍生物(PRP-S1和PRP-S2)在體內(nèi)都有顯著的抗腫瘤活性。與空白對(duì)照相比，PRP還顯示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。來自該菌的另一種硫酸酯化葡聚糖對(duì)單皰疹病毒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒活性，而相應(yīng)的未衍生化多糖則無活性。

大球蓋菇是北溫帶最著名的食用菌之一，具有令人愉悅的清新、酥脆的質(zhì)地，并伴有輕微的甜味。大球蓋菇還對(duì)高血糖、破骨細(xì)胞形成抑制、抗真菌作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制活性、抗腫瘤、抗癌等具有有益作用。它含有多種生物活性物質(zhì)，如多酚、多糖和膳食纖維。有研究表明，從大球蓋菇子實(shí)體中分離出中性多糖(SRP-1)和酸性多糖(SRP-2)。SRP-1和SRP-2均具有(1?→?6)-α-D-葡聚糖主鏈，但SRP-2具有比SRP-1更強(qiáng)的抗氧化能力。我們之前研究了在大球蓋菇胞外多糖(EPS)的制備過程、大球蓋菇的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件以及發(fā)酵過程中各項(xiàng)參數(shù)和生物量的變化與EPS產(chǎn)量之間的關(guān)系。并且證明了大球蓋菇胞外多糖具有一定的體外抗腫瘤活性和體內(nèi)降血糖活性，但是在抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中效果較差，該EPS在3.0 g/L時(shí)的DPPH和羥基自由基清除率僅達(dá)到20%~30%。為了提高大球蓋菇胞外多糖的抗氧化活性，進(jìn)一步制備了硫酸酯化衍生物，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。

Results and discussion

大球蓋菇胞外多糖及其硫酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

大球蓋菇胞外多糖EPS和其硫酸酯化衍生物S-EPS的FT-IR光譜如圖1所示，紅外結(jié)果表明多糖具有β-糖苷鍵，吸收峰在1 731cm?1左右證實(shí)了羧酸根的存在，說明EPS應(yīng)為一種酸性多糖。與EPS相比，S-EPS的FT-IR光譜中出現(xiàn)兩個(gè)新的特征吸收峰。1 211 cm?1處為硫酸跟S=O的拉伸振動(dòng)， 796 cm?1處為C–O–S彎曲振動(dòng)，說明引入了硫酸根基團(tuán)。S-EPS中的硫酸根含量約為17.95%，計(jì)算出取代度(DS)為2.12.DS值較高，這與FT-IR光譜數(shù)據(jù)一致，表明硫酸酯化成功。圖2顯示了EPS硅烷化分析的GC/MS總離子流圖。EPS主要由葡萄糖(54.8%)、甘露糖(28.8%)、葡萄糖醛酸(13.8%)以及少量其他糖殘基組成。這與FT-IR結(jié)果一致，表明EPS是一種酸性雜多糖。

圖

圖2 EPS的總離子流色譜圖

如13C NMR光譜(圖3)所示，在異構(gòu)碳區(qū)，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)主要信號(hào)，化學(xué)位移分別為95.2和102.4 ppm，這證明EPS同時(shí)含有α-構(gòu)型和β-構(gòu)型糖苷鍵。結(jié)合峰強(qiáng)度和紅外、質(zhì)譜結(jié)果，可以判斷EPS主要由β-葡萄糖和α-甘露糖組成。C4和C6向低場(chǎng)位移(分別為δ73.2~73.8和68.0~68.1)，表明EPS含有(1→4)鏈接和(1→6)鏈接。一般來說，多糖不同羥基的反應(yīng)活性為C-6>C-2>C-3>C-4.與C-2和C-4上的羥基相比，C-6上的羥基與硫酸基的親和力為10 倍。根據(jù)本研究中的DS值為2.12.EPS的大部分2-OH和6-OH應(yīng)被硫酸酯化。如圖2所示，C-6信號(hào)出現(xiàn)在59.5~0.5 ppm處，衍生后向66.1~66.6 ppm移動(dòng)，C-2信號(hào)出現(xiàn)在72 ppm處，衍生后向73.6~73.9 ppm移動(dòng)，這也證實(shí)了EPS的2-OH和6-OH基本被硫酸酯化?？偟膩碚f，EPS主要由β-葡萄糖和α-甘露糖組成，糖苷鍵類型主要為(1→4)鏈接和(1→6)鏈接。S-EPS的取代位置分別為C-2和C-6.

圖

大球蓋菇胞外多糖及其硫酸酯的鏈構(gòu)象

天然高分子的分子量以及鏈構(gòu)象等參數(shù)，對(duì)其生物活性也有重要的影響。本工作采用SEC-MALLS-RI測(cè)定了EPS和S-EPS的分子量和鏈構(gòu)象。如表1所示，EPS和S-EPS的重均分子量(Mw)確定為2.1×104 Da和1.4×104 Da，表明硫酸酯化反應(yīng)過程中多糖發(fā)生一定程度的降解，這應(yīng)該是由磺化試劑氯磺酸引起的。多分散指數(shù)(Mw/Mn)是分子質(zhì)量分布寬度的量度，可以看出S-EPS具有比EPS更高的分散性。然而，S-EPS在0.1 mol/L NaCl水溶液中的分子半徑(Rg)大于EPS。說明衍生化后的S-EPS發(fā)生降解，分子鏈段從原來相對(duì)致密的結(jié)構(gòu)打開，采用了更為舒展的鏈構(gòu)象，分子尺寸反而增加。Mw/Mn的增加也表明衍生化后EPS的鏈斷裂導(dǎo)致分散度的增加和分子量分布的展寬。

表1

基于聚合物稀溶液理論，第二維利系數(shù)A2為溶液中溶質(zhì)-溶質(zhì)和溶質(zhì)-溶劑相互作用強(qiáng)度的重要指標(biāo)。如果A2>0.溶劑-溶質(zhì)相互作用有利;A2<0時(shí)，溶質(zhì)-溶質(zhì)相互作用有利，可能導(dǎo)致聚集或沉淀。在25 ℃下通過SEC-MALLS檢測(cè)0.9% NaCl水溶液中的EPS和S-EPS的A2值。兩者 A2均接近零，但在衍生化之前為負(fù)值，表明溶質(zhì)-溶質(zhì)相互作用有利，可能導(dǎo)致EPS分子輕微聚集。多糖衍生后，A2值變?yōu)檎?，表明溶?溶質(zhì)相互作用有利，說明S-EPS在0.9% NaCl水溶液中具有更好分散溶解效果。總的來說，硫酸酯化后EPS降解為分子量較小的S-EPS，分子尺寸反而變大，親水性也更好。

大球蓋菇胞外多糖及其硫酸酯的抗氧化活性

由于擔(dān)心合成抗氧化劑在食品和其他領(lǐng)域潛在的生物毒性，人們?cè)絹碓疥P(guān)注用天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑。在天然抗氧化劑中，多糖在清除自由基方面起著重要作用。本工作測(cè)定了EPS和S-EPS對(duì)DPPH和羥基自由基的清除活性，結(jié)果如圖4所示。所有樣品的自由基清除活性均呈濃度依賴性。EPS和S-EPS對(duì)DPPH自由基的清除率均表現(xiàn)出相對(duì)較差的效果，它們具有相似的劑量依賴性(P<0.05)，最終在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)達(dá)到23.1%。隨著EPS濃度的增加，其羥基清除率呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，最終達(dá)到35.8%。S-EPS的羥基自由基清除活性顯著高于EPS，在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，其清除活性是EPS最高值的兩倍以上(72.1%)。

圖4 E

羥基自由基清除機(jī)制與金屬離子的傳遞有關(guān)。因此，能夠螯合金屬離子并使其失去活性的抗氧化劑分子可以清除羥基自由基。 S-EPS對(duì)羥基自由基的清除能力高于EPS，表明硫酸酯化修飾可以提高清除羥基自由基能力。S-EPS具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這可能是由于其更舒展的空間結(jié)構(gòu)。有研究表明，水溶性和分子量也是提高真菌葡聚糖某些生物活性的重要因素。比如，冬蟲夏草多糖硫酸酯衍生化后具有更高的水溶性、更低的分子量和更強(qiáng)的生物活性。另外，硫酸基團(tuán)可能在溶液中產(chǎn)生高酸性環(huán)境，使其更易通過靜電捕獲自由基。然而，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，EPS及其硫酸酯對(duì)?DPPH的清除率均較差，這與其他多糖及其硫酸酯的清除率相似。這也可能是由于多糖對(duì)兩種自由基的不同清除方式或者檢測(cè)方案等原因所致。比如，在常規(guī)的DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)過程中需要添加乙醇，而乙醇作為多糖的不良溶劑，可能會(huì)導(dǎo)致多糖鏈在溶液中聚集，從而大大降低多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。

Conclusion

采用醇沉法從大球蓋菇發(fā)酵液中提取了一種酸性胞外多糖(EPS)。采用氯磺酸-吡啶法合成了EPS的硫酸化衍生物(S-EPS)。通過FT-IR、NMR和SEC-MALLS-RI對(duì)EPS和S-EPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)和鏈構(gòu)象進(jìn)行了表征。FT-IR結(jié)果表明硫酸酯化修飾成功。EPS主要由甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，糖苷鍵類型主要為(1→4)鏈接和(1→6)鏈接。EPS的C6和C2的羥基在衍生化過程中被硫酸酯化。硫酸酯化制備了分子量較小、分子尺寸較大、親水性較好的S-EPS。此外，硫酸酯化衍生物S-EPS對(duì)羥基自由基的清除能力優(yōu)于EPS，有效地提高了抗氧化活性。

作 者 簡(jiǎn) 介

第一作者

郝輝，男，碩士，高級(jí)工程師，現(xiàn)為河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心主任工程師，主要研究方向?yàn)闊煵莼瘜W(xué)基礎(chǔ)研究、煙用材料應(yīng)用研究以及新型煙草產(chǎn)品設(shè)計(jì)與開發(fā)。獲省部級(jí)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)2項(xiàng)、三等獎(jiǎng)2項(xiàng)。在國(guó)內(nèi)外期刊公開發(fā)表科技論文40余篇，其中第一作者或通訊作者論文11篇，獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利20余件。參與制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)4項(xiàng)。

通信作者

高明奇，男，河南中煙技術(shù)中心材料研究所副主任，高級(jí)工程師，研究方向主要包括新型材料、煙草化學(xué)、增香保潤(rùn)等，近年來，參與3項(xiàng)煙草行業(yè)重大專項(xiàng)、20余項(xiàng)地廳級(jí)重點(diǎn)科研項(xiàng)目，獲省部級(jí)科技獎(jiǎng)勵(lì)2項(xiàng)、地廳級(jí)科技獎(jiǎng)勵(lì)10項(xiàng)，參與制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng)，發(fā)表科研論文40余篇，授權(quán)發(fā)明專利30余件。

許春平，男，荷蘭格羅寧根大學(xué)博士，教授，博導(dǎo)，河南省“百人計(jì)劃”特聘專家，河南省高層次人才B類，河南省高?？萍紕?chuàng)新人才，行業(yè)內(nèi)煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)委員，四川省、江西省、安徽省科技獎(jiǎng)勵(lì)評(píng)審專家，擔(dān)任Biotechnology and Bioprocess Engineering(SCI收錄)與Journal of Biologically Active Product From Nature編委?，F(xiàn)任鄭州輕工業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草局煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，鄭州輕工業(yè)大學(xué)科協(xié)副主席。主要從事生物化工和煙草工程研究。近年來，主持國(guó)家自然科學(xué)基金2項(xiàng)、省廳項(xiàng)目8項(xiàng)和河南中煙、廣西中煙、重慶中煙等企業(yè)橫向課題20余項(xiàng)，發(fā)表論文180余篇，其中SCI收錄120余篇，中科院一區(qū)12篇、二區(qū)20篇，高被引論文8篇，。出版學(xué)術(shù)專著11部，其中英文圖書4部。獲得河南省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng)，三等獎(jiǎng)二項(xiàng)，中國(guó)煙草總公司科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng)，河南省教育廳科技成果一等獎(jiǎng)二項(xiàng)，授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利16件。

Sulfation of the extracellular polysaccharide from the edible fungus

Hui Haoa, Chun Cuia, Yuqing Xingb, Xuewei Jiab, Bingjie Mab, Wenyi Kangc, Tianxiao Lib, Mingqi Gaoa,*, Chunping Xub,*

a China Tobacco Henan Industry Co. Ltd., Zhengzhou 450000. China

b College of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000. China

c National R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004. China

*Corresponding authors

Abstract

An acidic extracellular polysaccharide (EPS) was gained from Stropharia rugosoannulata fermentation broth by the alcohol precipitate method. Sulfated derivative of EPS (S-EPS) was gained by chlorosulfonic acid-pyridine method and the conditions were as follows: pyridine as the reaction solvent, temperature 80 ℃, and reaction time 90 min. The chemical structure and chain conformation of EPS and S-EPS were characterized by FT-IR, NMR and size exclusion chromatography (SEC) coupled with multi-angle laser light scattering (MALLS) detection. FT-IR spectra indicated the sulfated group was linked to the polymer. The EPS mainly consists of mannose, glucose and glucuronic acid, and the glycosidic bond type is mainly (1→4)-linked and (1→6)-linked. C6 and C2 were substituted by sulfate groups. The EPS was degraded into smaller molecular weight (Mw) polysaccharides with the larger molecular size (Rg) after sulfation and S-EPS has better hydrophilicity. Moreover, the sulfated derivative S-EPS was found to have a better scavenging ability on hydroxyl radicals than EPS. It proved that the chemical modification of S. rugosoannulata polysaccharides by sulfation effectively enhanced their antioxidant activity.

Reference:

HAO H, CUI C, XING Y Q, et al. Sulfation of the extracellular polysaccharide from the edible fungus Stropharia rugosoannulata with its antioxidant activity[J]. Journal of Future Foods, 2023. 3(1): 37-42. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.09.006.