我國作為全球最大的食用菌生產(chǎn)國，多年來年產(chǎn)量3500萬噸以上，占世界3/4，同時食用菌產(chǎn)業(yè)在循環(huán)農(nóng)業(yè)和促進農(nóng)民增收方面成效顯著，已成為我國特色農(nóng)業(yè)發(fā)展中的朝陽產(chǎn)業(yè)。近年來隨著食用菌品種選育、種質(zhì)交流和引種栽培等工作的快速推進，在生產(chǎn)和科研中面臨食用菌品種名稱繁多，同物異名，異物同名現(xiàn)象普遍存在的問題。然而現(xiàn)有的品種鑒定方法大多存在工作量大、精確性和重復性不足等問題，極大影響了產(chǎn)業(yè)發(fā)展和種質(zhì)創(chuàng)新進程。

多核苷酸多態(tài)性（Multiple Nucleotide Polymorphism，MNP）標記法是繼簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記法和單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記法后，于2020年成為植物品種鑒定的另一個國家標準（GB/T38551-2020）。其基本原理是在基因組內(nèi)存在多個SNP位點，將這些不同SNP位點的等位基因型組合起來，用于區(qū)分不同的個體DNA。目前MNP標記已成功應(yīng)用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品種鑒定。因為MNP標記法在篩選目標區(qū)段時避開了易出錯的序列，如SSR和連續(xù)的SNP位點；其次，基于高通量測序的MNP標記檢測克服了凝膠電泳中SSR擴增長度的不確定性和SNP標記的微陣列雜交噪聲；MNP位點會通過二代測序重復檢測上千次，重現(xiàn)性和準確性都會得到提升。此外當構(gòu)建完成具體物種的MNP標記位點數(shù)據(jù)庫后，在實驗操作上只需要將待測樣品DNA和混合MNP標記引物在一次PCR體系中擴增，并測序這些位點的序列即可，所以檢測的實際操作非常便捷。

雖然MNP標記技術(shù)在植物品種鑒定方面已取得了明顯成效，但由于植物的基因組顯著大于真菌基因組，此外食用菌普遍采用組織分離法復壯菌株或采用系統(tǒng)選育法育種，使得食用菌品種同質(zhì)化非常嚴重，不同品種（菌株）之間親緣關(guān)系極為密切，所以食用菌品種鑒定的標準和精確程度要求更高。此外不同品種的形態(tài)和性狀對不同栽培條件較為敏感，使得品種的準確鑒定難度進一步增大。

在本研究中，我們在植物品種MNP標記研究方法的基礎(chǔ)上，針對食用菌品種鑒定的實際需求和難點，開發(fā)出適合食用菌品種鑒定的方案和流程。以我國食用菌總產(chǎn)量第一，品種名稱超過500個的香菇[Lentinula edodes (Berk.) Pegler]為材料，在188個菌株基因組重測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，篩選得到501個廣泛MNP標記位點；通過相關(guān)引物設(shè)計和對78份香菇商業(yè)品種（包括25個國家品種委員會認定的香菇商業(yè)栽培品種、7個通過地方審定（鑒定、備案）品種、以及具有代表性狀、生物學特性和來自不同地域的栽培菌株）的多重擴增、MNP-Seq測序，構(gòu)建了我國香菇品種的MNP標記位點數(shù)據(jù)庫。通過檢測，它們的位點檢出率、重復率和準確率分別為94.4%、99.92%和99.96%，表明其標記效果良好。在此基礎(chǔ)上進一步篩選187個核心MNP標記位點，并利用240個菌株的核心位點序列構(gòu)建高精度的系統(tǒng)發(fā)育圖譜（圖1），并計算不同譜系間和品種間遺傳相似度（Genetic Similarity，GS，表1）。

研究結(jié)果表明：1）所有供試的栽培品種可以被區(qū)分為24個譜系：其中13個譜系的原始栽培品種來自日本，5個譜系來自中國（其中1個來自臺灣），3個譜系目前來源不明。綜合所有結(jié)果，除了唯一來自中國南方的栽培品種（香九）外，大多數(shù)香菇栽培品種原產(chǎn)于東北亞地區(qū)，中國的香菇品種存在嚴重的同質(zhì)化現(xiàn)象。2）劃定了區(qū)分不同譜系和品種的GS標準：當GS值小于或等于94%，為不同譜系的品種；GS值在94%-99.5%之間，可以被認為同一譜系中不同的栽培品種；當GS值高于99.5%時，則視為同一栽培品種。3）進一步完善了香菇品種精準鑒定的快速流程，實現(xiàn)簡單的實驗室操作（只需對待測樣品一次DNA提取，一次多重PCR擴增，一次送樣測序）后，通過MNP數(shù)據(jù)庫比對即完成待測樣品的品種精準鑒定。

本研究開發(fā)了香菇品種鑒定的廣泛MNP標記數(shù)據(jù)庫，并在此基礎(chǔ)上篩選出核心MNP標記，建立了香菇栽培品種的譜系圖、譜系和品種鑒定的標準流程及區(qū)分標準，實現(xiàn)精準快速鑒定香菇品種。此項工作為強化食用菌品種的原始創(chuàng)新（初始品種），鼓勵修飾性品種創(chuàng)新（派生品種），奠定了技術(shù)保障平臺。

圖1  基于187個核心MNP序列的香菇系統(tǒng)發(fā)育圖譜

表1  香菇參試品種的遺傳相似度（GS值）

相關(guān)論文在真菌領(lǐng)域權(quán)威期刊Mycosphere（2022年影響因子16.525，JCR 1區(qū)）在線發(fā)表，中國科學院微生物研究所碩士生凌云燕和博士生張明晢為該論文共同第一作者，湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所王卓仁高級農(nóng)藝師和中國科學院微生物研究所趙瑞琳研究員為論文共同通訊作者，江漢大學彭海教授、福建農(nóng)林大學吳小平教授為共同作者。研究工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0400200），國家自然科學基金項目（31961143010, 31970010）、北京市食用菌創(chuàng)新團隊（BAIC05-2022）、中科院農(nóng)業(yè)先進微生物技術(shù)工程實驗室（KFJ-PTXM-016）和河南省重點研發(fā)項目（221111110600）的資助。

相關(guān)論文鏈接Doi 10.5943/mycosphere/si/1f/3；專利受理號202210530743.4。