靈芝與糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子 生物學(xué)特性的初步研究（ 2004.02.14)

王淑珍1，范俊1，揚家峰1，揚英杰1，白晨2(1上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；

2復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200433)

靈芝(Ganoderma lucidum)是滋補強壯、扶正固本的珍貴藥用真菌，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對其研究更加深入，但未見過有關(guān)通過遺傳育種改變靈芝擔子果木栓質(zhì)化生物學(xué)特性的研究報道。若將外源DNA導(dǎo)入靈芝細胞，嵌入細胞的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)中，就有可能改變其木栓質(zhì)化遺傳特性。本研究是在對靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子基因組RAPD分析…的基礎(chǔ)上，分析檢測其部分生物學(xué)特性，以期了解融合子木栓質(zhì)化改變程度及木栓質(zhì)化與其他生物學(xué)特性的相關(guān)性。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1菌株長白山野生紫芝誘變高產(chǎn)菌株CJL990[2]，由上海師范大學(xué)王淑珍研究組提供；糙皮側(cè)耳(Peurotus ostreatus)菌株農(nóng)科2號，引自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。

1．1．2 PDA培養(yǎng)基供測定菌絲生長速度用。

1．2方法

1．2．1菌絲生長速度的測定將靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子(F1～F19)菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d，每天測量菌落生長直徑。兩親本與每株融合子均重復(fù)三次，計算平均值。

1．2．2液態(tài)培養(yǎng)生物量的比較分別取10小塊直徑O．15～0．25cm、于斜面上生長良好的靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子菌絲體，將其接入PDA液體培養(yǎng)基，于28℃、130r／min搖床培養(yǎng)。7d后，過濾收集菌絲體。用無菌水沖洗3遍，吸干水分置于培養(yǎng)皿中，于105℃烘干至恒重，記錄干重。融合子及親本菌絲均重復(fù)三次，求平均值。

1．2．3融合子菌絲形態(tài)的觀察分別在PDA培養(yǎng)基上插片培養(yǎng)親本菌絲和融合子菌絲，待菌絲生長到插片上0．5～0．7cm后，于200倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征并拍照。

1．2．4菌絲木栓質(zhì)化程度的測試將靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子(F1～F19)分別接種于裝200mL PDA液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于28℃淺層培養(yǎng)15d，長成直徑8cm、厚0．3cm的濕菌絲膜，再通過GB453-89恒速加荷法測定菌絲膜的抗拉強度，間接反映菌絲木栓質(zhì)化程度。

2結(jié)果

2．1菌絲生長速度

靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子(F1～F19)菌絲在PDA固體培養(yǎng)基中的生長速度見表1。

從表1可見，所有融合子7d的平均菌絲生長速度為5．08cm，介于兩親本之間。相對于靈芝，F(xiàn)1、F9的菌絲生長速度明顯減慢，而F3、F6、F7、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18和F19的菌絲生長速度則明顯提高。菌絲生長速度最快的F8，已與糙皮側(cè)耳的菌絲生長速度相同。

根據(jù)親本和所有融合子菌落直徑每天的平均生長值繪圖。從圖1可見，融合子菌絲的平均生長速度介于兩親本之間。

圖1 親本及其融合子在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度

Fig．1 Comparison Of mycelial growth rate 0f parent strains and the fusants On PDA medium

2．2液體培養(yǎng)靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子的生物量

從表2可見，融合子與親本在液體培養(yǎng)時生物量差異不大，其中菌絲生長速度較快的F8，生物量較高，所有融合子的平均生物量為7．99g/7d，介于兩親本之間，液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的親本及其融合子的生物學(xué)特性具有一定的相關(guān)性。

2．3靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子(F8)的菌絲形態(tài)

在200倍顯微鏡下觀察菌絲體，比較菌絲形態(tài)特征，箭頭所指為鎖狀聯(lián)合(圖2～4)。從圖2可見，靈芝及其融合子的菌絲長得較緊密，糙皮側(cè)耳菌絲較疏松。融合子菌絲感官觀察較透明，經(jīng)測微尺測定，其直徑為6．5～8μm，大于兩親本菌絲(靈芝菌絲3～5μm，糙皮側(cè)耳菌絲4．5～6μm)。

2．4靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子菌絲木栓質(zhì)化程度的比較

由表3可見，以抗拉強度表示的融合子菌絲的木栓質(zhì)化程度與靈芝菌絲相比均有不同程度下降。F12菌絲的抗拉強度為23．6N，其木栓質(zhì)化程度幾乎與靈芝相同；F8菌絲的抗拉強度最小，為16．9N，但也遠遠大于糙皮側(cè)耳的3．8N。菌絲抗拉強度的大小反映其韌性的強弱，抗拉強度大，其韌性也大，說明其木栓質(zhì)化程度高。

3討論

3．1靈芝和糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子與雙親的生物學(xué)特性具有不同程度的差別。靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子的基因組RAPD…和同工酶的分析[3]結(jié)果表明，融合子的譜帶有的與靈芝的相同，有的與糙皮側(cè)耳的相同。雖然本研究未進一步進行分子雜交法驗證[4]，但由RAPD的原理也足以說明，融合子的譜帶不是雙親譜帶的簡單疊加，融合子中還出現(xiàn)了新的譜帶，是原生質(zhì)體融合引起細胞核或細胞質(zhì)基因高頻重組的結(jié)果。初步證明，融合子生物學(xué)特性的改變與基因相關(guān)，從融合子與兩親本的相似系數(shù)來看，兩株融合子的平均Spf為60．65％，而Spf為32．35％?？梢钥闯鋈诤献优c靈芝更接近。

3．2融合子菌絲的木栓質(zhì)化程度與靈芝相比均有不同程度的下降，其中，F(xiàn)8的降幅最大。菌絲形態(tài)變化也大，表明融合子菌絲的木栓質(zhì)化程度與其它生物學(xué)特性(如菌絲的透明度和直經(jīng)大小)具有一定的相關(guān)性，即菌絲生物學(xué)特性變化大，其木栓質(zhì)化程度就低。

3．3 19株融合子菌絲木栓質(zhì)化程度不同，是否決定菌絲或子實體木栓質(zhì)化生物學(xué)特性的基因較復(fù)雜，不是單一基因，尚有待進一步研究。

參考文獻[1]王淑珍，白晨，范俊，等．靈芝與糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子基因組RAPD分析[J]．食用菌學(xué)報，2003，10(1)：1--4．

[2]王淑珍，白晨．靈芝孢子誘變與菌絲高長速菌株選育[J]．中國食用菌，2000，106(6)：6--9．

[3]王淑珍，范俊，高雁，等．孢子誘變菌株CJL990靈芝過氧化物酶和酯酶同工酶的研究[J]．上海師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000，29(4)：69--73．

[4]潘迎捷，陳明杰，汪昭月．原生質(zhì)體的融合子的遺傳驗證[J]．食用菌，1991，13(6)：14～15．