靈芝與糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子基因組RAPD分析

王淑珍?1 白 晨??2? 范 俊?1 高 雁?1 揚家峰?1 揚英杰?1

? （1 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；

?? 2復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200433）

作為一種傳統(tǒng)的滋補強壯、扶正固本的珍貴藥用真菌，靈芝?(Ganoderma lucidum)幾千年來一直被廣泛用于臨床治療和人體保健。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近10年來對靈芝的栽培、菌絲體工業(yè)化深層發(fā)酵及有效成分的研究逐漸深入。隨著分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué) 研究的進展，應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)進行靈芝種內(nèi)原生質(zhì)體融合的研究，以期獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的靈芝菌株。然而，這些研究主要集中在栽培、有效成分、藥理及臨床應(yīng)用方面，未見通過 遺傳育種改變靈芝擔(dān)子果木栓質(zhì)化生物學(xué)特性的研究報道?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)，靈芝屬近百種靈芝的擔(dān)子果均呈軟木質(zhì)或木質(zhì)化，這種組織結(jié)構(gòu)不僅給靈芝的食用和藥用帶來許多加工工藝上的 麻煩，而且由于木栓質(zhì)化，使靈芝不能象其他肉質(zhì)和革質(zhì)食用菌那樣食用，所以不可能做到物盡其用。即使是深層發(fā)酵的靈芝菌絲體，口感也近似軟木質(zhì)化結(jié)構(gòu)，難以咀嚼，如果加 工成食、藥用原輔料，微細化難度也遠大于一般食、藥用菌菌絲體。靈芝這種遺傳特性限制了其應(yīng)用范圍。近年來，利用外源遺傳信息改變遺傳特性的方法已成為遺傳育種中新的研究 焦點。若將外源DNA導(dǎo)入靈芝細胞，嵌入到細胞的遺傳物質(zhì)中，就有可能改變其木栓質(zhì)化遺傳特性。

?本研究旨在保持靈芝原保健功能的前提下，根據(jù)細胞工程和分子生物學(xué)理論，以肉質(zhì)食用菌擔(dān)子果為外源DNA供體，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，探討改變其木栓質(zhì)化生物學(xué)特性的方法與技術(shù)。

1 材料與方法

?? 1.1 菌株

?靈芝CJL990菌株系長白山野生紫芝的誘變高產(chǎn)菌株［1］，由上海師范大學(xué)王淑珍研究組提供。糙皮側(cè)耳農(nóng)科2號，引自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。融合子F3、F8，由上海師范大學(xué)王淑珍研究組根據(jù)其優(yōu)良生物學(xué)特性初篩獲得。

? 1.2 試劑

?12種引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，核苷酸序列見表1。

?表1 核苷酸序列及試驗編號

Table 1 The experiment nos. and the nucleotide sequences of 12 primers

試驗編號?Experiment nos.

核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide

試驗編號?Experiment no s.

核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide

01

GGGTAACGCC

07

CTACTGCCGT

02

TGAGGGTCCC

08

TTATCGCCCC

03

GGTGCGGGAA

09

GAGTCTCAGG

04

GTGACATGCC

10

CACCAGGTGA

05

TCAGGGAGGT

11

CTTCACCCGA

06

AAGACCCCTC

12

TCACCACGGT

? LETS緩沖液組成：100mM LiCl 0.424g，10mM EDTA 0.372g，20mM Tris 0.242g，0 .5% SDS 0.5g。將上述試劑溶解在80mL重蒸水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.8～8.0，定容至100mL，加入蛋白酶K，至終濃度為50mg/100mL。

?50×TAE緩沖液組成：Tris 242g，冰醋酸57.1mL，0.5M EDTA(pH8.0)100mL，加蒸餾水至 1L。

?上樣緩沖液組成：40%蔗糖，0.25%溴酚藍。

?苯酚∶氯仿∶異戊醇：于50mL水飽和苯酚中加入24mL氯仿和1mL異戊醇，使其配比為25∶2 4∶1。

?1.3 總DNA的提取??［2，3］?

?菌株接種于液體培養(yǎng)基中，于26℃培養(yǎng)10d后，過濾收集菌絲體。取0.1g菌絲體，無菌重 蒸水淋洗后用濾紙吸干，放入1.5mL的離心管中，每管加400μL LETS緩沖液，并用研棒研磨菌絲。加500μL苯酚、氯仿、異戊醇混合液（25∶24∶1），充分混勻，14000r/min離心10 min。取300μL上清液于一新的離心管中，加600μL(2倍體積)無水乙醇，混勻，14000r/min 離心10min，去上清液，真空干燥沉淀物后加40μL無菌重蒸水，溶解，用華舜公司的植物總 DNA抽提柱過柱純化，70%乙醇（或Wash Buffer）離心洗滌兩次，最后加20μL無菌重蒸水，于65℃洗脫。取1μL純化后的總DNA，用0.8％的瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳檢測 。

?1.4 RAPD反應(yīng)

?模板DNA定量：用紫外分光光度計測定提取的不同菌株的DNA濃度，稀釋，使其終濃度為5～10ng/μL。

?RAPD反應(yīng)體系： 反應(yīng)體系的總體積為25μL， 其組分為2.5μL 10×PCR Buffer ， 2μL2mM MgCl?2，1μL DMSO，1.5μL dNTP，1μL Taq酶（Sangon），5μL隨機 引物（3.3ng/ μL），1μL DNA稀釋模板（以ddH2O為空白對照），11μL ddH?2O。

?反應(yīng)條件：反應(yīng)在MJ Research PTC?225 PCR儀上進行。擴增反應(yīng)程序為：94℃ 變性5min，92℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，共進行45個循環(huán)，最后72℃補平 10min，終止溫度為4℃。

?產(chǎn)物檢測：取10μL反應(yīng)液，加2.5μL電泳樣品緩沖液，在1×TAE電泳緩沖體系中，用?1 .4％?瓊脂糖凝膠電泳分離DNA擴增片段，EB染色，于凝膠分析儀下觀察結(jié)果并拍照。

? 1.5 相似系數(shù)的統(tǒng)計

?對擴增DNA片段按相似率Sxy=2?Nxy/(Nx+Ny)×100%進行相似指數(shù)(Simi larity index)分析，其中Nxy是比較后兩種材料x和y共有的DNA片段數(shù)目，Nx和Ny分別為材料x和y各自的DNA擴增片段數(shù)目。

2 結(jié)果

? 2.1 引物的篩選

?試驗所采用的12個隨機引物中，有4種引物能有效地同時對靈芝、糙皮側(cè)耳及其融合子的D NA進行擴增，它們分別是07、10、11和12號引物。用這4種隨機引物進行重復(fù)實驗，擴增出 的隨機片段大都在3.5kb～0.5kb之間(圖1，圖2)。

表2 4種隨機引物的擴增譜帶

?Table 2 The amplication bands with 4 random primers

供試材料?Materials tested

譜 帶總數(shù)Total no.?of the bands

GFP共同譜帶GFP common?bandsGP

GP共同譜帶 GP common?bands

GF共同譜帶GF common?bands

FP共同譜

FP common?b ands

靈芝?G.lucidum? (G)

52

--

12

--

--

融合子 Fusant (F3)

57

9

--

35

12

融合子 Fusant (F8)

60

15

--

32

20

糙皮側(cè)耳 ?P.ostreatus? (P)

40

--

12

--

--

? 1～6號泳道分別為G、 F3、 P、 G、 F3、 P用不同引物的擴增結(jié)果

?M為分子量標(biāo)記，從上到下依次為10kb、 8kb、 6kb、 5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 1.5kb 、 1kb和0.5kb，N為空白對照

?Lanes 1～6 are the amplicons of G，F(xiàn)3，P，G，F(xiàn)3，P amplified with different pr imers

?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb resp. N： The blank contrast

?

圖1 融合子F3的RAPD分析?Fig.1RAPD analysis of fusant F3

?????????????

? 1～6號泳道分別為G、 F8、P、G、F8、P用不同引物的擴增結(jié)果

?M為分子量標(biāo)記，從上到下依次為10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb 、1kb和0.5kb，N為空白對照

?Lane 1～6 are the amplicons of G，F(xiàn)8，P，G，F(xiàn)8，P amplified with different pri mers

?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb，resp. N： The blank contrast

?圖2 融合子F8的RAPD分析?Fig. 2 RAPD analysis of fusant F8

? 2.2 四個樣品擴增譜帶相似率

?根據(jù)表2的數(shù)據(jù)計算F3、F8兩融合子與兩親本的相似系數(shù)：SGF3=64.2%，SGF8=57.1%；SPF3=24.7%，SPF8=40.0%；SGP=26.1%。

? 2.3 融合子和親本株擴增的譜帶類型

?從圖1和圖2擴增結(jié)果可見，靈芝與糙皮側(cè)耳相同的譜帶較少(S??GP?＝26.1%)。二株融合子的平均SGF＝60.65%，而SPF＝32.35%，可見，融合子的生物學(xué)特性與靈芝更接近。

3 討論

?3.1 本研究所制備的靈芝和糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體，是采用雙層培養(yǎng)法進行原生質(zhì)體再生［4］，將靈芝和糙皮側(cè)耳兩親本對潮霉素自然抗藥性的差異結(jié)合原生質(zhì)體滅活［ 5］作為融合子篩選的依據(jù)。

?3.2 根據(jù)RAPD原理，每種隨機引物擴增的1條譜帶代表了被擴增的基因組中的一個遺傳位點。因此，本研究中四種隨機引物總共檢查了靈芝的52個位點，兩株融合子的117個位點（平均每株58.5個），糙皮側(cè)耳的40個位點，表明融合子與兩親本基因組中的遺傳位點總數(shù)有差別。

?3.3 靈芝與糙皮側(cè)耳為不同目的大型藥用菌與食用菌。靈芝屬多孔菌目，靈芝屬；糙皮側(cè)耳屬傘菌目，側(cè)耳屬。兩者親緣關(guān)系較遠，其基因組內(nèi)的同源序列較少，只有當(dāng)引物結(jié)合 位點之間的序列區(qū)段在兩親本之間同源時，PCR擴增產(chǎn)物的帶型才會相同，從擴增結(jié)果來看，相同的譜帶較少（SGP=26.1%），差異明顯（圖1，圖2）。

?3.4 融合子的譜帶有的與靈芝相同，有的與糙皮側(cè)耳相同，其基因組DNA既有與靈芝同源的序列，又有與糙皮側(cè)耳同源的序列。筆者對靈芝、糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子基因組進行了 RAPD分析。初步證實，該融合子確為兩親本原生質(zhì)體融合后的融合子，將在此基礎(chǔ)上進一步做分子雜交［6，7］試驗。

?3.5 根據(jù)Williams等（1990）的實驗，RAPD符合孟德爾遺傳規(guī)律，雖然本實驗中發(fā)現(xiàn)雙親的共有譜帶基本上都可在融合子中找到，部分單親譜帶也出現(xiàn)在融合子中，但融合子的譜 帶不是雙親譜帶的簡單疊加，融合子中還出現(xiàn)了新的譜帶（圖1，圖2），這可能是融合后基因重組引起引物結(jié)合位點改變的結(jié)果。如果將融合子擴增譜帶分別與兩親本作比較，從融合 子與兩親本的相似系數(shù)來看，兩株融合子的平均SGF為60.65%，而SPF為32.35% ?？梢钥闯鋈诤献优c靈芝更為接近，符合我們的育種目的。

?3.6 有關(guān)靈芝木栓質(zhì)化生物學(xué)特性改變與否及改變程度，目前仍在研究。

?? 參 考 文 獻

? ［1］ 王淑珍，白 晨. 靈芝孢子誘變與菌絲高長速菌株選育［J ］.中國食用菌，2000，106（6）：6～9.

?［2］ Lee SB, Taylor　JW.Isolation of DNA from fungal mycelia and singl e spore.In: PCR Protocols:A guide to methods and applications (Gelfand MA , Sninsky DH, White JJ, TJ Eds.)［M］. New York：Academic Press，1990,282～287 .

?［3］ Sobral BWS, Honeycutt RJ. Hight output gentic mapping of p olyploids using PCR?generated markers［J］. Theor Appl Genet，1993，86:105～11 2.

?［4］ 李 剛，李寶健.影響靈芝原生質(zhì)體再生的幾個因素［J］．食用菌學(xué)報，1998，5 （3）：12～17.

?［5］ 彭衛(wèi)憲，陸大京.用滅活原生質(zhì)體融合進行高溫香菇育種［J］.真菌學(xué)報，1987，6 （3）：184～192.

?［6］ 陳明杰，譚 琦.應(yīng)用RAPD技術(shù)對香菇融合菌株進行遺傳鑒定［J］. 食用菌學(xué)報，1997，4（4）：17～20.

?［7］劉國振，劉振岳，賈建航，等.用RAPD方法對平菇、香菇屬間原生質(zhì)體融合 子的研究［J］.遺傳，1995，2（1）：7～11.