作物物理誘變新技術(shù)研究進展

林　彤　　歐　琳

（福建師范大學(xué)，福州　350007）

摘　要　概述了激光生物工程技術(shù)和離子束注入技術(shù)的作用機理、特點和產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，及其在作物誘變育種中的研究與應(yīng)用。

關(guān)鍵詞　作物誘變　激光生物工程　離子束注入

　　選育優(yōu)良品種是促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的必由之路。大量研究和生產(chǎn)實踐表明，誘變育種可克服常規(guī)育種周期長、進程慢、難以獲得突變性變異品種的缺點，可在創(chuàng)造作物新種質(zhì)、新材料和解決育種工作中某些特殊問題取得突破和高速發(fā)展，繼γ射線、中子、EMS、NaN等傳統(tǒng)的理化誘變手段之后，激光技術(shù)和離子束注入技術(shù)在探討誘變育種新途徑方面的應(yīng)用，成為極為活躍的研究領(lǐng)域。激光生物工程的崛起與離子束注入技術(shù)的發(fā)展，將有力推動植物基因工程在育種上的應(yīng)用，使誘變育種工作提高到一個新的階段。

1　激光生物工程技術(shù)

1.1　激光微束技術(shù)　利用激光亮度高、光譜純、可調(diào)諧、發(fā)散角小等其它光源沒有的特點，將激光束用光學(xué)系統(tǒng)加以聚焦，形成非常細(xì)的光束，光斑直徑小到幾微米，甚至十分之幾微米，稱為激光微束。激光微束在細(xì)胞內(nèi)聚焦，不破壞細(xì)胞膜，卻能對細(xì)胞核和細(xì)胞器進行操作，如可去掉細(xì)胞壁，進行細(xì)胞融合、切割染色體等，因此被認(rèn)為是光刀。60年代末，Berns等開始用激光微束進行了一系列研究，1970年證明激光微束可誘發(fā)染色體畸變。中國科學(xué)院遺傳研究所也進行了大量工作：胡應(yīng)和（1982）等用激光誘發(fā)微核仁的形成，梁宏等用激光微束引起核仁缺失，得到具有單核仁的細(xì)胞，成功率在50%以上。近幾年國內(nèi)外的研究趨勢是激光微束在高等植物特別是農(nóng)作物上的應(yīng)用。我國的梁宏、陸仲康等以農(nóng)作物種子根尖細(xì)胞為材料，首先報道了用激光微束切割高等植物的染色體，成功地把蠶豆、小麥、玉米和大麥染色體切割成4～12片段。并且建立了激光切割植物染色體的實驗技術(shù)，為進一步把這一技術(shù)方法應(yīng)用于植物染色體工程、基因定位及植物染色體片斷DNA的微克隆打下了基礎(chǔ)。

1.2　激光細(xì)胞融合技術(shù)　利用物理或化學(xué)的方法將兩個相互接觸的細(xì)胞融合為一個細(xì)胞的技術(shù)稱為細(xì)胞融合,是細(xì)胞工程的重要內(nèi)容之一,是一種在細(xì)胞水平上的遺傳操縱。若兩個細(xì)胞貼在一起,用高峰值功率密度激光對細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進行輻照,質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,可產(chǎn)生微米量級的微孔,由于質(zhì)膜上的微孔是可逆的,質(zhì)膜分子在重組過程中借助細(xì)胞連接處小孔的表面曲率很高，處于高張力狀態(tài)，細(xì)胞逐漸由啞玲狀變?yōu)閳A球狀，細(xì)胞就融合了。1987年Wiegand等報道了激光誘導(dǎo)油菜原生質(zhì)體融合的結(jié)果，1992年中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究院等試用金盞菊葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體探索激光誘導(dǎo)植物體細(xì)胞融合的方法，取得了初步成功。激光細(xì)胞融合法與其它化學(xué)物理方法相比較具有許多優(yōu)點：（1）能選擇任意兩個細(xì)胞之間進行融合；（2）因僅在兩個細(xì)胞的接觸點照射激光，故作用于細(xì)胞的應(yīng)力和障礙小;（3）可進行非接觸、安全且遠距離的無菌操作；（4）能適時觀察融合過程。

1.3　激光導(dǎo)入外源基因　利用人工方法從一種生物中提取某種基因，注入到另一種生物細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞接受，經(jīng)培育生長而具有預(yù)期的變異性狀的一種生物，此種技術(shù)稱為外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。1987年聯(lián)邦德國的Weber報道了用激光微束單脈沖照射將DNA直接導(dǎo)入油菜細(xì)胞和葉綠體。中科院王蘭嵐等人及清華大學(xué)沈子威等廣泛地選用了不同科屬植物及不同種的植物進行外源基因?qū)耄芯拷Y(jié)果表明，激光微束轉(zhuǎn)化法可廣泛應(yīng)用于各種植物，而且對細(xì)胞的損傷小，轉(zhuǎn)化頻率高，實驗程序簡便，重復(fù)性好，并能準(zhǔn)確地定位于被照射細(xì)胞，對不同種的植物細(xì)胞可通過控制脈沖次數(shù)來調(diào)節(jié)能量。經(jīng)激光微束處理的細(xì)胞可不加抑菌的抗生素以免除對細(xì)胞的損傷。1993年王蘭嵐等人又報道了利用微束激光將外源基因?qū)胄←溣着卟@得轉(zhuǎn)基因植株。被認(rèn)為是世界首例。1995年美國貝克曼激光研究所也報道了將外源基因成功地轉(zhuǎn)入水稻而培育成基因工程植株。此外，對細(xì)胞中的葉綠體打孔，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞器中也成為一種實用技術(shù)。利用激光給油菜的離體葉綠體打開一個臨時性小孔，可將外源DNA整合到此細(xì)胞器中并被吸收，基因能在處理過的細(xì)胞或細(xì)胞器上表達。激光微束法導(dǎo)入外源基因的成功，為高等植物特別是重要糧食作物的遺傳轉(zhuǎn)化開辟了一條新途徑。

2　離子束注入技術(shù)

　　離子束注入生物學(xué)效應(yīng)是我國科技人員于80年代中期發(fā)現(xiàn)并迅速投入誘變育種應(yīng)用的新研究領(lǐng)域。離子束注入種子，誘變后種子損傷輕，突變率高，突變譜廣，有助于培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的新品種。由于離子束注入具有高激發(fā)性、劑量集中和可控性，可進行定向誘變，已成為當(dāng)代植物改良和作物育種的一種新的重要手段。

2.1　作用機理　能量為幾十至幾百KeV的荷能離子通過發(fā)生器注入生物體內(nèi)，在其到達終位前，使同靶材料中的分子原子發(fā)生一系列的碰撞。它們之間相互作用的過程隨著離子能量逐漸降低而變化。起初以非彈性碰撞過程為主，使生物分子電離或激發(fā)導(dǎo)致電離損傷。隨之彈性碰撞起主要作用，導(dǎo)致靶原子移位，留下斷鏈或缺陷。當(dāng)入射離子能量損失達到峰值，慢化的原初離子將以高斯分布的形式沉積下來。如果注入離子是活性離子，則它們在沉積過程中將不斷與生物分子鍵合、置換，形成新的分子基團。伴隨著入射離子的能量沉積，其中一小部分能量將隨著動量方向到達表面，引起生物體表面的二次離子發(fā)射，即濺射。特別指出的是在離子注入與生物體相互作用的峰值范圍內(nèi)其相互作用是局部的，雙重的和不易修復(fù)的。因此，離子注入用于作物誘變有可能在損傷輕的情況下獲得較高的突變率和較寬的突變譜。

2．2　生物學(xué)效應(yīng)及育種研究　離子束注入具有顯著的生物效應(yīng)。在各種植物處理中不僅可以發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)變異，而且發(fā)現(xiàn)了三級和四級連續(xù)易位等高級結(jié)構(gòu)變異。染色體畸變類型和頻率與注入離子種類、劑量以及生物體部位有關(guān)。離子束注入引起細(xì)胞壁剝離，細(xì)胞排列紊亂，形狀變化巨大，細(xì)胞被拉長、扭曲和絞鏈，細(xì)胞間質(zhì)基本上被蝕，留下很深的溝槽和孔洞。離子注入可引起生物體多種生理變化損傷，如導(dǎo)致葉綠體畸變，引起呼吸代謝、過氧化物酶、自由基以及自由基清除酶等的變化。

　　目前，離子束注入植物品種改良已涉及幾乎所有主要的糧食和經(jīng)濟作物。據(jù)悉，已育成的兩個水稻新品種晚D9055和S9042米質(zhì)優(yōu)、抗性好，1994年累計推廣應(yīng)用3多萬hm2，鄭冬官等利用離子束注入棉花種子，選育出4個高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲和早熟新品系，其中一個早熟新品系已經(jīng)進入省級區(qū)試。吳躍進等把離子束注入溫敏型水稻的當(dāng)代，選育出黃花葉水稻突變體。蔡得田等利用N+離子注入水稻無融合生殖材料，使后代無融合生殖率從14%提高到48%，獲得了高頻無融合生殖水稻HDAR001。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)利用離子束處理玉米種子獲得了高光效的多穗型材料，為玉米高產(chǎn)育種提供了一種珍貴的基因資源。1990年以來，安徽農(nóng)科院等利用離子束介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已將Gus基因?qū)胨竞兔藁◣П诩?xì)胞，并將外源赤霉素抗性基因（hph）導(dǎo)入水稻種胚細(xì)胞，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。低能離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移直接利用種子胚做外植體，省去了原生質(zhì)體制備和再生植株的麻煩，便于大量操作和取材，為植物，尤其是農(nóng)作物基因工程注入了新的活力。

　　此外，利用空間條件引起植物遺傳性變異的空間誘變手段也正處于積極的研究探索階段，也已顯露出誘人的前景。上述的幾種物理誘變新技術(shù)實驗驗證與育種應(yīng)用之間的周期大為縮短，是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的結(jié)果。然而，這些誘變手段的應(yīng)用與研究還剛剛起步，能否高效率誘變出使用傳統(tǒng)因素難以獲得的突變體或迄今自然界罕見的種質(zhì)材料，最終成為新的誘變源和誘變因素，有待于在理論機制方面進一步驗證，在育種實踐中進一步探索。隨著科學(xué)的發(fā)展和各學(xué)科的互相滲透，這些新的誘變手段將不斷完善和發(fā)展，為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)作出貢獻。