毛木耳多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白激酶A活性的影響
王道福 邵林萍 鞠保文 丁望
(89醫(yī)院 濰坊261000)
毛木耳多糖(Auricularia polytrica Sacc polysac caride，APSP)系從擔(dān)子菌綱銀耳科毛木耳(Auricularia polytrica Sacc)子實(shí)體中提取，具藥食兩用價(jià)值，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，毛木耳多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤作用，但其作用機(jī)制尚未明確。為進(jìn)一步探討毛木耳多糖的作用機(jī)理，本文采用PLC法，測定毛木耳多糖均一體組分APSP－A對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MΦ)PKA活性的影響。
1 材料和方法
1.1 藥品和試劑毛木耳多糖(APSP－A)：按文獻(xiàn)方法提取〔1〕，化學(xué)性質(zhì)屬酸性雜多糖，由甘露糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖及少量糠醛酸組成，4種單糖的分子比為320∶10∶018∶005，分子量12萬，實(shí)驗(yàn)時(shí)以EPES緩沖液配成所需濃度，濾膜過濾，消毒，4℃保存。RPMI－1640培養(yǎng)基：Gibco生命技術(shù)公司產(chǎn)品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程公司。EPES緩沖液(p 72～74)、Sucrose、DTT、Leupetin、histone(Ⅲ－s)、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP均為Sigma產(chǎn)品。甲醇、PiCA，皆為國產(chǎn)色譜純。
1.2 動(dòng)物：昆明種純系小鼠，♀♂不限，7～8周齡，體重232～255g，由昌濰醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.3 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：按文獻(xiàn)方法〔2〕無菌取小鼠腹腔MΦ，經(jīng)苔盼藍(lán)染色細(xì)胞活率90%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為108～109/L，接種于多孔培養(yǎng)板中，置含5%CO2，95%空氣孵箱中，37℃孵育24。對照組皆以RPMI－1640完全培養(yǎng)基替代，實(shí)驗(yàn)組中加測試藥物等處理因素皆以RPMI－1640完全培養(yǎng)基溶解和稀釋。
1.4 PKA活性測定
1.4.1 PKA的制備：按文獻(xiàn)方法[3]操作。
1.4.2 PKA活性測定：參考文獻(xiàn)[4]以反相離子對高效液相色譜法測定〔4〕。色譜條件：C18柱、流動(dòng)相：甲醇：磷酸鹽緩沖液(21∶79V／V，p69，內(nèi)含6mmol/L PiCA)、流速1ml/min、檢測波長259nm、柱溫為室溫、0.01AUFS、進(jìn)樣量10～20μl。
1.4.3 蛋白含量測定：按Lowry法測定。
1.4.4 PKA活力定義：一個(gè)酶活力單位相當(dāng)于每分鐘使組蛋白istone(Ⅲ－s)磷酸化而消耗1nmol ATP所需的酶量。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以?x±s表示，所有結(jié)果顯著性差異皆以配對資料t檢驗(yàn)處理。
2結(jié)果
毛木耳多糖對小鼠MΦ中PKA活性的影響：以80mg/L APSP－A與MΦ一起孵育不同時(shí)間后，測定PKA總活力。結(jié)果顯示：APSP－A可明顯增強(qiáng)小鼠腹腔MΦ中PKA總活力，8min時(shí)達(dá)到峰值，至20min恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(圖1)。在8min時(shí)APSP－A與PKA的量效關(guān)系具有一定濃度依賴性(r=08958，表1)，實(shí)驗(yàn)測得PKA的基礎(chǔ)總活力為(9686±688)nmol?min－1?mg－1(n=3，x±s)。
3討論
蛋白激酶是催化體內(nèi)蛋白磷酸化的酶類，而蛋白磷酸化則是體內(nèi)各種生物反應(yīng)最終起作用的通路。PKA是一類cAMP依賴性蛋白激酶，是整個(gè)cAMP作用的分子基礎(chǔ)，在真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有cAMP的作用都是通過活化PKA，從而使底物蛋白發(fā)生磷酸化而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)證明毛木耳多糖可引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PKA活性明顯升高并具有一定濃度劑量依賴性，提示其免疫增強(qiáng)作用可能與活化PKA有關(guān)。
參 考 文 獻(xiàn)
1 吳春敏，等毛木耳多糖的分離、分析及免疫藥理活性的研究中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)1991；22(2)：97
2 鄂征主編組織培養(yǎng)技術(shù)北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：185
3 李明春，等靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白激酶A活性的影響中草藥2000；31(5)：353
4 李明春，等反相離子對PLC法測定細(xì)胞中蛋白激酶活性中國生化藥物雜志1999；20(5)：233
