靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)三萜酸定性分析
中草藥 1999年第8期第30卷 藥劑與工藝
作者：李平作* 夏結(jié)紅 章克昌
單位：無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 214036
關(guān)鍵詞：靈芝；四環(huán)三萜酸；紫外光譜；抑菌實(shí)驗(yàn)
摘 要 以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑，以硫酸-甲醇(1∶1)為顯色劑，通過(guò)硅膠薄層層析法由靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到3種四環(huán)三萜酸，命名為M1、M2和M3，其Rf值分別為0.56，0.49，0.17。并對(duì)這3種物質(zhì)的紫外光譜特性進(jìn)行了研究?？咕鷮?shí)驗(yàn)顯示3種四環(huán)三萜酸具有抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的活性。
靈芝中四環(huán)三萜類化合物是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的靈芝中另外一類具有明顯藥理活性的化合物。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于四環(huán)三萜類化合物，具有護(hù)肝和排毒［1］、降血壓［2］、降膽固醇［3］等作用。靈芝中四環(huán)三萜首先由Kubota［4］等從靈芝G. lucidum的子實(shí)體中得到；此后Nishitoba［5］和Hirotani［6］等作了較多的研究報(bào)道；國(guó)內(nèi)這方面的研究起步較晚，陳若蕓［7］在他們的綜述中論及靈芝中四環(huán)三萜酸的研究進(jìn)展；王芳生等［8］報(bào)道了赤芝子實(shí)體中四環(huán)三萜進(jìn)行了較深入的研究［9］。筆者報(bào)道了靈芝四環(huán)三萜酸的定性分析方法、紫外光譜特征及抑菌活性。
1 材料和方法
1.1 材料：試劑均為分析純；硅膠(層析用)300 目，青島海洋化工廠；薄層板5×20 cm，自制；753 W紫外分光光度計(jì)。
1.2 方法
1.2.1 靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)三萜酸的提?。?］：發(fā)酵液經(jīng)真空濃縮至原體積的1/5，過(guò)濾后，用水飽和正丁醇提取3 次，合并正丁醇提取液，后減壓濃縮至干，殘?jiān)苡谶m量的甲醇中，即為粗四環(huán)三萜酸。
1.2.2 深層發(fā)酵：25 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積125 L，發(fā)酵溫度30℃，通風(fēng)量1∶0.75，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量1 L，起始pH 5.5，發(fā)酵96 h。
1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)-濾紙透明圈法［10］：①上層培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖5，NaCl 5，瓊脂18，pH 7.2。下層培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2。
?、谝志Чu(píng)價(jià)：接種細(xì)菌濃度為107 CFU/mL，靈芝酸濃度50 mg/L。抑菌圈直徑5～6 mm為+，7～10 mm為++，抑菌圈不明顯為-。
2 結(jié)果與討論
2.1 靈芝中四環(huán)三萜酸薄層定性分析：利用薄層層析法進(jìn)行中草藥有效成分的定性分析至今仍是一種常規(guī)的檢測(cè)方法。在運(yùn)用該方法時(shí)首先要確定的是采用何種展開劑。我們選擇4種展開劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。
表1 不同展開劑條件下四環(huán)三萜酸的Rf值
系統(tǒng)1 系統(tǒng)2 系統(tǒng)3 系統(tǒng)4 代號(hào)
0.26 0.28 0.70 0.56 M1
0.62 0.65 0.67 0.49 M2
0.12 0.15 0.55 0.17 M1
系統(tǒng)1-正己烷-乙酸乙酯(1∶1)
系統(tǒng)2-正己烷-乙酸乙酯：乙醚(1∶1∶1)
系統(tǒng)3-氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9∶1∶1)
系統(tǒng)4-甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)
顯色劑：硫酸-甲醇(1∶1)溶液
由表1中可以看出，4種展開系統(tǒng)都有3個(gè)明顯斑點(diǎn)，它們的Rf值在0.15～0.70之間。由于展開劑的極性不同，使得各物質(zhì)的Rf值不同。以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑時(shí)，由于加入少量乙酸，使得分離結(jié)果非常理想。因此我們選擇系統(tǒng)4為展開劑。
顯色劑的選擇：分別以三氯乙酸和硫酸-甲醇為顯色劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，前者皆顯黃色，加熱時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度不高。以硫酸-甲醇(1∶1)為顯色劑時(shí)，加熱時(shí)間短，顯色速度快，120℃加熱15～20 min即顯色。而且以硫酸-甲醇為顯色劑時(shí)，還可以判別三萜酸基本結(jié)構(gòu)的飽和與不飽和情況［10］。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到M1(Rf=0.56)和M2(Rf=0.49)先顯亮紅色，然后變?yōu)樽仙?；M3(Rf=0.17)則由橙色變?yōu)樽仙?，這表明三種靈芝中四環(huán)三萜酸都具有不飽和特性，否則呈黃色并逐漸褪色。因此我們選擇硫酸-甲醇=1∶1為顯色劑，圖1是以系統(tǒng)4為展開劑時(shí)靈芝中四環(huán)三萜酸的薄層層析圖譜。
圖1 靈芝四環(huán)三萜酸的薄層層析圖譜
2.2 靈芝中四環(huán)三萜酸的紫外光譜特征：由于靈芝中四環(huán)三萜酸中含有共軛體系，因而通常在紫外區(qū)有吸收峰。將分離的3種四環(huán)三萜酸在紫外區(qū)進(jìn)行吸收掃描，得到如下的譜圖(圖2)。
從圖2中可以看出，3種四環(huán)三萜酸在220～260 nm中都有不同程度的吸收峰，已有的文獻(xiàn)報(bào)道［7］也證明靈芝中四環(huán)三萜酸在此范圍內(nèi)有明顯的吸收。由圖2可以看出M1的最大紫外吸收峰在254 nm左右；M2的最大吸收峰在243 nm左右；M3的最大吸收峰在224 nm左右。
圖2 M1、M2、M3紫外光譜圖
2.3 靈芝中四環(huán)三萜酸的抗菌活性：通過(guò)濾紙透明圈法檢測(cè)了靈芝酸對(duì)不同微生物的抑菌活性。結(jié)果見表2。
表2 靈芝酸的抑菌作用
腸炎桿菌 產(chǎn)氣桿菌 金黃色
葡萄球菌
大腸桿菌 枯草桿菌
M1 ++ ++ ++ ++ +
M2 + ++ + ++ -
M3 ++ + + ++ -
3 小結(jié)
3.1 確定了靈芝中四環(huán)三萜酸的硅膠薄層定性分析法，適宜的展開劑組成是甲苯-乙酸乙酯-乙酸＝12∶4∶0.5；顯色劑組成是硫酸-甲醇=1∶1，而且利用該顯色劑可以初步判斷靈芝中四環(huán)三萜酸母核上的不飽和性。分離得到的3種靈芝三萜酸的Rf值分別為0.56，0.49，0.17。
3.2 紫外吸收光譜表明，M1的最大吸收在254 nm，與有關(guān)的報(bào)道基本相一致。在C11位不存在羰基的化合物，大都有△7［8］△9［11］雙鍵，其紫外吸收大多在237 nm，244 nm，253 nm，M2的紫外光譜特征在此范圍內(nèi)。而在既沒(méi)有α、β不飽和酮，又沒(méi)有共軛雙鍵的化合物中，紫外吸收在λmax210 nm左右，M3有可能屬于此范圍。
3.3 抗菌實(shí)驗(yàn)顯示3種四環(huán)三萜酸具有抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的活性。
參考文獻(xiàn)
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4 Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982， 62:611
5 Nishitoba T, et al. Agr Biol Chem, 1984, 48:2905
6 Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull， 1986, 34:2282
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9 李平作.無(wú)錫輕工大學(xué)博士論文，1997.12
10 錢存柔，等編.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：北京大學(xué)出版社，1985：196
11 Wall M E, et al. J Biol Chem， 1952, 198：533
