靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白激酶A活性的影響

中草藥 2000年第5期第31卷 藥理實(shí)驗(yàn)與臨床觀察

作者：李明春　梁東升　許自明　雷林生　楊淑琴　孫莉莎

單位：李明春 梁東升 許自明（中國人民解放軍401醫(yī)院藥劑科　青島 266071）；雷林生 楊淑琴 孫莉莎（第一軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室）

關(guān)鍵詞：靈芝；靈芝多糖；巨噬細(xì)胞；蛋白激酶A

　　摘　要　為觀察靈芝多糖(GLB7)體外對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MΦ)蛋白激酶A(PKA)活性的影響，采用反相離子對高效液相色譜法測定MΦ中RKA活力。結(jié)果表明GLB7(40 mg/L)能引起小鼠腹腔MΦ中PKA活性明顯升高，10 min達(dá)峰值，30 min恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。提示靈芝多糖的免疫增強(qiáng)作用與其增強(qiáng)MΦ中PKA活性有關(guān)。

Effects of Ganoderma (Ganoderma lucidum) Polysaccharide on PKA Activity of

　　Murine Peritoneal Macrophages

　　Li Mingchun, Liang Dongsheng and Xu Ziming

　　（Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA 　Qingdao 266071）

　　Lei Linsheng, Yang Shuqin and Sun Lisha

　?。―epartment of Pharmacology, the First Military Medical University）

　　Abstract　　To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLB7) on protein kinase A (PKA) activity of murine peritoneal macrophages. A new ionpair RP-HPLC method was used to determine the activty of PKA in cells. The results showed that GLB7 (40 mg/L) activated the PKA of murine peritoneal macrophages, to a peak value within 10 min, and then recovered to its basic level after 30 min. This result indicated that GLB7 may act as an immunopoteniator of PKA in murine peritoneal macrophages.

　　Key words　　Ganoderma lucidum (Leyee.ex Fr.) Karst　Ganoderma lucidum polysaccharide　macrophage　protein kinase A (PKA)

　　靈芝多糖是靈芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst的主要活性成分。以往實(shí)驗(yàn)證明靈芝多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤作用，它能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MΦ)的吞噬功能，促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)，促進(jìn)未經(jīng)純化的脾細(xì)胞在體外的增殖，增強(qiáng)DNA多聚酶α的活性以及促進(jìn)白細(xì)胞介素2的分泌等［1～4］。但靈芝多糖的免疫作用機(jī)制尤其是對免疫細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有何影響尚不清楚。本文利用反相離子對高效液相色譜測定技術(shù)，觀察靈芝多糖對小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶A(PKA)的影響，以探討靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

　　1　材料和方法

　　1.1　藥品與試劑：靈芝多糖(GLB7)，按文獻(xiàn)方法提取［5，6］，化學(xué)組成是以葡萄糖、半乳糖為主的雜多糖，糖苷鍵連接方式以β(1→4)為主，稍多α(1→6)，分子量9 000。RPMI-1640培養(yǎng)基，為Gibco產(chǎn)品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品。Sucrose、DTT、Leupetin、Histone (Ⅲ-s)、PM-SF、ATP、ADP、AMP、cAMP均為Sigma產(chǎn)品。甲醇、PiCA，皆為國產(chǎn)色譜純。

　　1.2　動(dòng)物：BALB/c純系小鼠，?♀不限，8周齡，體重18～22 g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　1.3　巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：按文獻(xiàn)方法［7］無菌取小鼠腹腔MΦ，經(jīng)苔盼藍(lán)染色細(xì)胞活率95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為109～1010/L，接種于多孔培養(yǎng)板中，置于含5%CO2、95%空氣孵箱中，37 ℃孵育24 h。對照組皆以RPMI-1640完全培養(yǎng)基替代，實(shí)驗(yàn)組中加測試藥物等處理因素皆以RPMI-1640完全培養(yǎng)基溶解和稀釋。

　　1.4　RKA活性測定［8］

　　1.4.1　PKA的制備：于培養(yǎng)的細(xì)胞體系中加入200 μL PKA提取液，內(nèi)含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, DTT 2 mmol/L, Leupetin 5 mg/L, PMSF 1 mmol/L, Sucrose 200 mmol/L, CaCl2 1 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L。冰浴下超聲粉碎。900×g離心5 min，去除碎片和胞核，得上清即為胞漿組分和膜性組分，以此用于測定PKA總活力。以上操作皆于4 ℃以下進(jìn)行。

　　1.4.2　PKA活性測定：用反相離子對高效液相色譜法測定［8］。色譜條件：C18柱；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液(20∶80，pH7.0，內(nèi)含5 mmol/L PiCA)；流速：1 mL/min；檢測波長：259 nm；柱溫：室溫；0.01AUFS、進(jìn)樣量20 μL。PKA反應(yīng)體系中包括PKA反應(yīng)液，內(nèi)含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, MgCl2 5 mmol/L,組蛋白(Histone,Ⅲ-s) 1 g/L, DTT 2 mmol/L, ATP 0.5 mmol/L, cAMP 2 μmol/L和適量酶液(按蛋白含量計(jì))，反應(yīng)總體積為1 mL。先將除酶液以外的其它溶液混勻，30 ℃預(yù)熱5 min，再加入酶液起始反應(yīng)。反應(yīng)開始后于30 ℃水浴搖床中準(zhǔn)確保溫10 min，立即置于沸水浴中1 min終止反應(yīng)；冷卻后離心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 mL氯仿-甲醇(2∶1)混合物，振蕩1 min，抽提脂溶性物質(zhì)，200×g離心5 min；小心吸出水層，其中含ATP、ADP和AMP。重復(fù)前步驟處理1次，合并提取液，低溫凍存待測。

　　1.4.3　蛋白含量測定：按Lowry法測定。

　　1.4.4　PKA活力定義：一個(gè)酶活力單位相當(dāng)于每分鐘使Histone (Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。

　　2　結(jié)果

　　2.1　反相離子對HPLC法測定PKA：在上述色譜條件下，ATP、ADP和AMP三種物質(zhì)可呈現(xiàn)良好的分離，在樣品測定中，雜質(zhì)峰不影響ATP的測定(圖1)。

A-標(biāo)準(zhǔn)品　　B-樣品

1　反相離子對HPLC法測定MΦ中PKA色譜圖

　　2.2　GLB7對小鼠MΦ中PKA活性的影響：以40 mg/L GLB7與MΦ一起孵育不同時(shí)間后，測定PKA總活力。結(jié)果顯示：GLB7可明顯增強(qiáng)小鼠腹腔MΦ中PKA總活力，10 min達(dá)到峰值，至30 min恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(圖2)。在10 min時(shí)GLB7與PKA的量效關(guān)系具有一定濃度依賴性(r=0.878 9，表1)，實(shí)驗(yàn)測得PKA的基礎(chǔ)總活力為(80.93±4.52) nmol/(min?mg)(n=6，±s)。

A-實(shí)驗(yàn)組；　B-對照組；　GLB7濃度為40mg/L

2　GLB7對小鼠腹腔MΦ PKA活性的影響時(shí)程

表1　GLB7對小鼠MΦ PKA活性的影響(n=6，±s)

GLB7

　　(mg/L)

PKA總活性(nmol/min?mg)

實(shí)驗(yàn)組 對照組

10 288.14±11.81 81.32±7.45

20 377.19±13.38 80.07±5.47

40 442.71±13.45 80.84±9.41

80 489.25±19.28 79.89±11.26

160 537.74±21.25 87.04±10.37

　　與對照組比較：P＜0.013　討論

　　關(guān)于蛋白激酶的測定方法，目前國內(nèi)外一般采用32P-γ-ATP磷酸化組蛋白法測定PKA活力。雖然同位素法靈敏度高，但存在放射性污染，加之條件要求高，不易進(jìn)行。以HPLC法測定PKA的活性，不僅避免了同位素污染，而且方法簡便、重現(xiàn)性好(RSD=0.18%)、準(zhǔn)確性及靈敏度高(回收率99.63%)。其測定原理是：ATP在PKA反應(yīng)體系中作為提供磷酸的物質(zhì)，使底物磷酸化，同時(shí)降解為ADP和(或)AMP，其中ATP的消耗量與PKA之活力成正比。

　　蛋白激酶是催化體內(nèi)蛋白磷酸化的酶類，而蛋白磷酸化則是體內(nèi)各種生物反應(yīng)最終起作用的通路。PKA是一類cAMP依賴性蛋白激酶，是整個(gè)cAMP作用的分子基礎(chǔ)，在真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有cAMP的作用都是通過活化PKA，從而使底物蛋白發(fā)生磷酸化而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)證明靈芝多糖可引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PKA活性明顯升高，提示其免疫增強(qiáng)作用可能與活化PKA有關(guān)。但其活化途徑仍需進(jìn)一步研究。

　　Add ress: Li Mingchun, Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingda o

　　國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目　No/39400165

　　李明春　男，副主任藥師。1987年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，獲學(xué)士學(xué)位：1998年畢業(yè)于 第一軍醫(yī)大學(xué)，獲藥理學(xué)碩士學(xué)位，研究方向?yàn)槊庖咚幚怼＝陙碓趪鴥?nèi)外期刊上發(fā)表論文 10余篇，獲軍隊(duì)科技成果獎(jiǎng)6項(xiàng)。現(xiàn)主要從事臨床藥理學(xué)研究工作。?

參 考 文 獻(xiàn)

　　1，林志彬.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，24(4)：271

　　2，雷林生，等.基礎(chǔ)與臨床，1992，12(2)：59

　　3，Lei L S, et al. Acta Pharmaceutical Sinica, 1992,27(5):331

　　4，Lei L S, et al. J Beijing Med Univ, 1991, 23(4):329

　　5，李榮芷，等.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，23(6)：473

　　6，何慶云，等.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，21(3)：225

　　7，鄂　征主編.組織培養(yǎng)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：185

　　8，李明春，等.中國生化藥物雜志，1999，20(5)：233