作者單位：1 200041 上海，上海市第一人民醫(yī)院分院腫瘤科
2 上海，解放軍第85醫(yī)院
3 上海，上海白衣緣生物科技有限公司(Δ通訊作者)
【摘要】 目的 探討灰樹花β多糖在抗腫瘤細(xì)胞中的作用和協(xié)同化療藥物增加其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。另外通過對(duì)p53和MDM2的研究，發(fā)現(xiàn)了兩者協(xié)同作用的分子機(jī)理。方法 用CCK-8方法測(cè)定了灰樹花β多糖協(xié)同化療藥物處理HCT116后的細(xì)胞存活率(cell survival rate，CSR)；用PCR的方法測(cè)定了p53、MDM2基因的表達(dá)。結(jié)果 (1)灰樹花β多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用高于靈芝多糖。(2)灰樹花β多糖協(xié)同化療藥物增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。(3)灰樹花β多糖協(xié)同化療藥物的分子機(jī)理和抑制抑癌基因p53的拮抗物MDM2基因的表達(dá)相關(guān)。結(jié)論 灰樹花β多糖具有直接殺傷腫瘤作用和化學(xué)藥物協(xié)同抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】 灰樹花；化療藥物；p53；MDM2
The initial exploration of antitumor action and its molecular mechanism by the Grifola frondosa polysaccharide synergistic with chemotherapeutic drugs
LU Zheng-yu，PU Hong， FU Rong-jie，et al.Department of Oncology，The Branch of the Shanghai First People’s Hospital，Shanghai 200041，China
【Abstract】 Objective The efficiency of anticancer therapy is limited by drug reistance.Recent studies suggest that a polysaccharide extracted from Grifola frondosa is able to kill cancer cells in vivo and in vitro.However， the molecular basis for the polysaccharide from Grifola frondosa synergistic effects with cytotoxic drugs has to be well defined.Methods HCT116 cell survival rate were monitoued by CCK-8 kit.p53 and MDM2 gene expression were checked by semiquantitative PCR analysis of cellular RNA.Results Here we showed the polysaccharide from Grifola frondosa had more great anti-cancer effect than shell-broken spores of G. lucidum in HCT116 cell.Moreover the polysaccharide from Grifola frodosa was detected synergistic effects with cytotoxic drug (ADM). Conclusion We present the evidence that anti-apoptotic gene MDM2 expression may be involved in augented the polysaccharide from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to ADM-treatment.
【Key words】 grifola frondosa；chemotherapeutic drug；p53；MDM2
灰樹花(Grifola frondosa)是一種生長(zhǎng)在亞熱帶至溫帶的大型藥、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、貝葉多孔菌等，日本稱之為“舞茸”。在分類學(xué)上屬擔(dān)子菌綱多孔菌科，其口味鮮美、營養(yǎng)豐富，含有眾多活性物質(zhì)，灰樹花多糖就是最主要的一類活性成分?；覙浠ǘ嗵浅笑?1，6-支鏈β-1，3-葡聚糖外還含有大量高度分支化的β-1，3-支鏈β-1，6-葡聚糖，研究表明，這種特定的結(jié)構(gòu)使其擁有更強(qiáng)的生物調(diào)節(jié)活性［６］。作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，灰樹花多糖具有增強(qiáng)免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒、穩(wěn)定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝等廣泛的生理活性［１］。
灰樹花β多糖具有明顯的抗腫瘤作用，能激活機(jī)體免疫細(xì)胞群如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，并可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌如IL-2、IL-8、IL-12、γ-INF、TNF-α等，增強(qiáng)腫瘤局部免疫反應(yīng)，抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移［２～４］。
化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用在一定程度上限制了它對(duì)惡性腫瘤的治療作用。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用10%牛血清(PAA Laboratories Gmbh)DMEM(PAA Laboratories Gmbh)培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)人腸癌細(xì)胞系HCT116。
1.2 細(xì)胞毒性分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，常規(guī)消化成2×１０４/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。5%CO2、37℃ 環(huán)境中培養(yǎng)24h后對(duì)HCT116細(xì)胞分別用零處理；一天灰樹花β多糖(3μg/ml)；一天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)；二天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)；第一天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)、第二天灰樹花β多糖(3μg/ml)的五種不同的方法處理，次日每孔細(xì)胞中加入5μl的CCK-8試劑，5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)450nm處讀取光密度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率(cell survival rate，CSR)。
公式：
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)表示，采用t檢驗(yàn)。
1.4 RNA抽提和RT-PCT RNeasy kit (Qiagen)提取藥物處理過的HCT116細(xì)胞總RNA并合成相應(yīng)的cDNA，分別對(duì)p53和Mdm2作RT-PCR，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。引物序列：p53正5′-GGCCATCTACAAGCAGTCAC-3′，p53反5′-GAGAGGAGCTGGTGTTGTTG-3′；Mdm2正5′-GGTGAGGAGCAGGCAATTG-3′，Mdm2反5′-GCGTCCCTGTAGATTCACTGC-3′。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 灰樹花β多糖直接抑制腫瘤細(xì)胞的作用 眾所周知，靈芝破壁孢子粉是目前被廣泛用于腫瘤患者輔助治療各種腫瘤的一種保健藥物。為了探究灰樹花［１］對(duì)腫瘤細(xì)胞直接的殺傷作用［６～７］，我們用各種濃度的靈芝破壁孢子粉和灰樹花β多糖對(duì)人的腸腫瘤細(xì)胞HCT116株進(jìn)行處理，48h后測(cè)得腫瘤細(xì)胞HCT116的生存率，結(jié)果如圖1所示，我們可以觀察到與靈芝破壁孢子粉相比，灰樹花β多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)大［８］，而且這種作用是隨著劑量的遞增而增強(qiáng)的。
圖1 灰樹花β多糖和靈芝破壁孢子粉對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用
用各種不同劑量的灰樹花β多糖和靈芝破壁孢子粉
作用于處理HCT116細(xì)胞48h后，細(xì)胞生存率結(jié)果用
Cell Counting Kit-8檢測(cè)獲得 另外，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們所用的起始濃度非常低(從0.05μg/ml)，由此可以判斷灰樹花β多糖從很低的濃度開始就有明顯的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
2.2 灰樹花β多糖對(duì)化療藥物的協(xié)同抗腫瘤作用 為了檢測(cè)灰樹花β多糖、化療藥物(阿霉素)以及二者一起使用的協(xié)同作用，我們對(duì)HCT116細(xì)胞分別用零處理；一天灰樹花β多糖；一天化療藥物(阿霉素)；二天化療藥物(阿霉素)；第一天化療藥物(阿霉素)；第二天灰樹花β多糖的五種不同的方法處理。次日再用CCK-8藥盒測(cè)得HCT116細(xì)胞的生(殘)存率，如圖2所示：我們發(fā)現(xiàn)和零處理比較，單用灰樹花β多糖有較弱的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力(約為9%的殺傷力)，而化療藥物(阿霉素)單日和雙日使用均有十分明顯的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力(約50%和78%的殺傷力)。而第一天用化療藥物(阿霉素)第二天再用灰樹花β多糖處理，其二者的協(xié)同作用對(duì)腫瘤細(xì)胞有高達(dá)80%的殺傷力。眾所周知，化療藥物(阿霉素)雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力強(qiáng)，但是毒副作用也十分明顯。病人長(zhǎng)期連續(xù)使用會(huì)嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，也阻礙了治療的深入進(jìn)行。而灰樹花本身是一種幫助調(diào)節(jié)和恢復(fù)各種身體機(jī)能的真菌多糖類滋補(bǔ)品。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)第一天用化療藥物處理，第二天改用灰樹花β多糖的處理，不但沒有減弱其直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力(80%)，而且還能在臨床應(yīng)用時(shí)幫助恢復(fù)病人的整體機(jī)能和大大提高病人的生活質(zhì)量。
在這實(shí)驗(yàn)中同時(shí)我們也測(cè)試了第一天用灰樹花β多糖、第二天化療藥物(阿霉素)這樣的順序組合其協(xié)同作用的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有前一種順序的強(qiáng)(只有50%的殺傷力，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示)。另外，除了阿霉素，我們還測(cè)試了其他多種臨床上常用的化療藥物如：5-FU、CDDP、泰素等均有明顯的協(xié)同作用。
圖2 灰樹花β多糖與化療藥物協(xié)同抗腫瘤作用
分別用灰樹花β多糖3μg/ml和化療藥物(阿霉素)2μg/ml處理
HCT116細(xì)胞，細(xì)胞生存率結(jié)果用Cell Counting Kit-8檢測(cè)獲得2.3 灰樹花β多糖協(xié)同化療藥物抑制MDM2基因的表達(dá) 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，人腸腫瘤HCT116細(xì)胞的抑癌基因p53表達(dá)為野生型。p53是一種非常重要的抑癌基因，它的功能主要表現(xiàn)為控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［１０，１１］。所以p53蛋白質(zhì)又被稱為“警戒蛋白”，在正常細(xì)胞中p53基因表達(dá)量是十分低下的，但是有些腫瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)卻異常高，HCT116細(xì)胞株就是一例。通常認(rèn)為p53的表達(dá)異常高的腫瘤細(xì)胞中MDM2的量也十分高：即MDM2拮抗了p53的功能［１２～１３］。本文為了研究灰樹花β多糖和化療藥物抗腫瘤細(xì)胞協(xié)同作用的分子機(jī)理，我們用PCR方法，半定量化檢測(cè)了p53基因和MDM2［１４～１６］基因在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)HCT116細(xì)胞的處理是：零處理、1日灰樹花β多糖、1日化療藥物(阿霉素)、2日化療藥物(阿霉素)；第一天化療藥物(阿霉素)；第二天灰樹花β多糖處理五種不同方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，HCT116細(xì)胞中p53基因的表達(dá)總體水平都十分高，但有趣的是，用灰樹花β多糖處理后MDM2基因的表達(dá)下降，而且在第一天用化療藥物(阿霉素)第二天用灰樹花β多糖處理后這種降低MDM2基因表達(dá)的作用被大大的增強(qiáng)了。
圖3 灰樹花β多糖與化療藥物協(xié)同作用
對(duì)MDM2基因表達(dá)的影響
分別用灰樹花β多糖3μg/ml和化療藥物(阿霉素)
2μg/ml處理HCT116細(xì)胞，抽提RNA用RT-PCR分析
p53和MDM2基因的表達(dá)，GAPDH作為對(duì)照 這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們有理由相信在HCT116細(xì)胞中，第一天用化療藥物(阿霉素)；第二天用灰樹花β多糖的處理方式在抗腫瘤作用中的協(xié)同作用是通過抑制抑癌基因的拮抗物MDM2基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
3 討論
灰樹花的抗腫瘤功效一直得到國際學(xué)術(shù)界的注目。尤其是灰樹花β多糖在提高人體免疫機(jī)能等方面的研究更是層出不窮。但是灰樹花β多糖和化療藥物協(xié)同抗腫瘤作用以及分子機(jī)理的研究卻還有待開發(fā)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了灰樹花β多糖直接殺傷腫瘤的作用高于目前被廣泛使用的靈芝破壁孢子粉。另外灰樹花β多糖和化療藥物的協(xié)同抗腫瘤作用也十分明顯。通過更深入的分子生物學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn)著名的抑癌基因p53和其拮抗蛋白MDM2基因的表達(dá)下降參與了這個(gè)作用。
p53是目前世界上被研究得最為透徹的抑癌基因。它的主要功能是當(dāng)細(xì)胞由于外界因素而使DNA遭受損傷時(shí)，p53基因即被激活，由此而激活其下游的蛋白質(zhì)p21(sip1/waf1/sidi1)的表達(dá)而使細(xì)胞停止生長(zhǎng)并進(jìn)行修復(fù)，而當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重時(shí)，p53又能啟動(dòng)其凋亡信號(hào)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在正常細(xì)胞中p53的表達(dá)量非常低，而在有些腫瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)卻異常的高，這是因?yàn)檫@些腫瘤細(xì)胞中p53的拮抗蛋白MDM2的表達(dá)相當(dāng)高、嚴(yán)重抑制了p53的正常功能。本研究中我們發(fā)現(xiàn)灰樹花β多糖和化療藥物的協(xié)同作用可以大大地降低MDM2基因的表達(dá)。
發(fā)掘祖國醫(yī)藥寶庫并且通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段闡明其作用的分子機(jī)理是中醫(yī)中藥現(xiàn)代化的一條切實(shí)可行的途徑。我們?cè)谶@個(gè)研究中雖然只是初步的嘗試，但是得到了一個(gè)令人振奮的結(jié)果。
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