2、單孢分離　就是將采集到的孢子群?jiǎn)蝹€(gè)分開進(jìn)行培養(yǎng)，讓它單獨(dú)萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。

　?。?）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個(gè)孢子/毫升，吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落，其步驟如下：

　?、僦苽錈o(wú)菌水試管：取10支試管，其中1支裝100毫升蒸餾水，其它9支裝9毫升蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌即成無(wú)菌水。

　?、谥奇咦討乙海喝∫恍K收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無(wú)菌水試管中， 搖振使孢子分散成懸液，用無(wú)菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中， 搖振使其分期，再?gòu)牡?支試管中吸取1毫升注入第3支試管中， 如此反復(fù)稀釋直到孢子濃度達(dá)到300-500個(gè)孢子/毫升，備用。

　?、壑婆囵B(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基，裝入三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌， 準(zhǔn)備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過高壓滅菌備用，待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時(shí)，在無(wú)菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放平，晝使培養(yǎng)基表面光滑，厚度一致。

　　④孢子涂布：在無(wú)菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上，使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上，蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿，放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

　　⑤挑選單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過５天的培養(yǎng)開始萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個(gè)孢子萌發(fā)成長(zhǎng)而成的，可使用打孔器進(jìn)行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。 打孔器的外徑應(yīng)小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會(huì)觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。

　　（2）毛細(xì)管法：孢子懸浮液經(jīng)過稀釋，使用毛細(xì)滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi)，晝使每一滴只含有一個(gè)孢子，從而達(dá)到單孢子分離，其方法如下：

　?、冁咦討腋∫褐苽渫♂尫蛛x法，孢子濃度控制在200-300個(gè)孢子/毫升。

　?、诿?xì)滴管制備：取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細(xì)管， 稍冷卻后再加熱并迅速拉長(zhǎng)，使管尖內(nèi)徑約200微米，剪斷即成毛細(xì)滴管，在滴管后端塞棉花， 裝入消毒盒中后進(jìn)行滅菌備用。

　?、埸c(diǎn)樣鏡檢：用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴)，在無(wú)菌操作下，快速點(diǎn)于皿蓋內(nèi)壁的標(biāo)記圈中央，滴液應(yīng)小于低倍鏡的視野， 點(diǎn)樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上，貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴，確定是單孢者，即在皿蓋上標(biāo)上記號(hào)。

　?、芘囵B(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標(biāo)記為單孢子的液滴，使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個(gè)皿蓋對(duì)接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣)，這樣就形成一個(gè)刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室，置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng)，待單孢子萌發(fā)，及時(shí)撕下膠布，用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊，移接到新鮮PDA斜面試管中，置24℃恒溫箱中培養(yǎng)，即可區(qū)得單孢純種。