一、孢子分離法
蘑菇孢子分離法，是利用成熟子實(shí)體的有性擔(dān)孢子能自動(dòng)從子實(shí)體層中彈射出來(lái)的特征，在無(wú)菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上，使孢子萌發(fā)成菌絲，獲得純種的一種方法。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔(dān)孢子（是指其細(xì)胞核已經(jīng)地核配過(guò)程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來(lái)保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應(yīng)用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個(gè)步驟，首先是采集孢子，其次進(jìn)行單孢或多孢子分離。
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1、種菇的選擇 采集孢子首先要選好種菇即分離用的子實(shí)體。一般蘑菇種菇要求是第一潮菇，出菇較早，單生，個(gè)體健壯，特征典型的子實(shí)體，經(jīng)過(guò)仔細(xì)的觀察篩選后在菇床上做個(gè)記號(hào)，讓種菇充分生長(zhǎng)，直至即將破膜時(shí)將菇采摘進(jìn)行孢子彈射。
2、孢子彈射收集 種菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用無(wú)菌濾紙把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進(jìn)行表面消毒。隨后用無(wú)菌刀切掉多余菌柄（約留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無(wú)菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖 所示）。這套孢子收集裝置需事先進(jìn)行高壓滅菌消毒。把裝好子實(shí)體的孢子彈射收集器放在溫度為15-20℃的室內(nèi)，經(jīng)24-48小時(shí)左右， 可見到無(wú)菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。在無(wú)菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無(wú)菌的空試管中，并在溫度下進(jìn)行真空干燥，之后放入冰箱可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/div>
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1、多孢分離法 即把多個(gè)孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長(zhǎng)交錯(cuò)在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個(gè)孢子間的種性互補(bǔ)，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性，此法比較簡(jiǎn)易，在過(guò)去的蘑菇制種中應(yīng)用較為普遍。
（1）斜面劃線法：按無(wú)菌操作規(guī)程，用無(wú)菌接種環(huán)從收到孢子的濾紙條上沾取少量孢子，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上自下而上劃線，劃線時(shí)勿用力， 以免劃破培養(yǎng)基表面，接種完畢，抽出接種種灼燒試管口，塞上棉塞，放置24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后（一般約15-20天），挑選萌發(fā)快，長(zhǎng)勢(shì)旺的菌落， 轉(zhuǎn)接于新試管培養(yǎng)基上再行培養(yǎng)。
?。?）涂布分離法：按無(wú)菌操作方法，取一小塊具有孢子的濾紙條，放入裝有無(wú)菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液，然后用已滅菌的試管，吸取孢子懸浮液，滴1-2滴到PDA試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。孢子在培養(yǎng)基上經(jīng)24℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)后，挑選幾株發(fā)育勻稱，生長(zhǎng)速度快的菌落，移接于另一試管斜面培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)即為母種。
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