靈芝菌種的分離方法有組織分離法、孢子分離法以及基質(zhì)內(nèi)菌絲分離法。這3種分離方法各有特點：基質(zhì)內(nèi)菌絲分離因易污染較少采用；孢子分離法又稱有性繁殖，一般在研究及菌種復(fù)壯時采用；一般大規(guī)模生產(chǎn)時常采用組織分離法，該操作簡便，且能保持原有菌種的優(yōu)良品性。

　　一、子實體組織分離法

　　選取形態(tài)發(fā)育正常、無病蟲害、未彈射靈芝孢子的靈芝子實體，菌蓋邊緣尚在生長的黃白色子實體。它們具有較強(qiáng)的再生能力和保持親本種性的能力，屬于無性繁殖范疇。組織分離取材廣泛、操作簡便、易于成功，是靈芝純菌種的簡便分離方法。

　　1、幼蕾分離 切取靈芝菌柄先端膨大的幼蕾，在無菌條件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼燒后的刀片從柄部淺切1刀，掰開兩半后用鋒利的接種刀挑切取幼蕾內(nèi)菌肉1小塊，移接至斜面中央，28℃下遮光培養(yǎng)，菌絲長滿斜面即為母種。

　　2、菌蓋分離 選取子實體生長正常、健壯和未成熟的子實體，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌蓋正反面，然后在菌蓋邊緣黃白色生長圈處，切破皮殼，掰下一塊幼嫩菌蓋，用灼燒后的解剖刀在斷面菌肉上作縱橫切割成米粒大的組織片，置無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，最后用接種刀將組織片移接至斜面上，28℃下遮光培養(yǎng)。整個操作需嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。

　　未形成靈芝菌蓋的幼嫩芝柄亦可作為分離材料。

　　二、靈芝孢子分離法

　　孢子分離法從靈芝子實體中收集成熟的有性擔(dān)孢子，并將其培養(yǎng)萌發(fā)成純菌絲的方法。由孢子分離得到的菌絲具有菌齡短、生活力強(qiáng)，同時有性孢子具有雙親的遺傳特性，是選育新菌株和雜交育種的材料。但是孢子分離污染率高，經(jīng)及時清理污染的試管。

　　1、孢子的采集 以赤芝為例，選取個體典型、菌蓋呈紅褐色、有光澤、發(fā)育成熟、無白色生長圈，瓶(袋)上見有少量散落孢子粉，大小適中，無病蟲害的子實體，切去菌柄，用棉球蘸取0.1%升汞溶液，反復(fù)擦拭菌蓋正反面，菌孔一面宜輕，然后用無菌水充分沖洗，并以無菌紗布吸干水分。孢子采集方法有以下幾種：

　?、佟椛浞?在無菌條件下，用灼燒后的粗注射針將切去靈芝菌柄處鉆1個深達(dá)菌肉的小孔，插在培養(yǎng)皿的鐵絲架上，培養(yǎng)皿放在鋪有紗布的搪瓷盆內(nèi)，外罩上鐘罩或無底蘑菇瓶，置28－30℃相對濕度90%的條件下培養(yǎng)。當(dāng)有大量褐色靈芝孢子粉落入培養(yǎng)皿后，除去鐘罩及支架，將培養(yǎng)皿蓋好，并用透明膠帶封貼或無菌紙包扎備用。所用器材均需事先用紙包扎滅菌并進(jìn)行無菌操作。

　?、凇①N附法 錐形瓶(即三角燒瓶)內(nèi)分裝入1cm厚的PDA培養(yǎng)基，加棉塞滅菌，冷卻成平板。無菌條件下將去柄的子實體如上述作表面消毒處理，放在無菌紙上，沿菌管方向切若干個小塊，然后拔出錐形瓶塞，將子實體小塊的皮殼部蘸上膠水粘貼在棉花塞底部，塞回錐形瓶口上。置28-30℃下培養(yǎng)，見有棕色孢子下落在培養(yǎng)基表面，即可在無菌條件下除去棉塞上的菌塊。

　　貼附法也可粘貼在試管斜面正上方的管壁上。若菌蓋厚可削去部分皮殼和菌肉，見斜面上散落有孢子時，除去菌塊。

　　2、菌絲培養(yǎng) 在無菌條件下，把彈射法收集到的孢子，用接種環(huán)蘸取少許抖落在斜面上，或?qū)㈡咦由僭S放入試管內(nèi)無菌水中(采用20%靈芝子實體煮汁更理想)制成孢子懸液，然后蘸涂在斜面或平板上，置28－30℃下培養(yǎng)。貼附法在平板或斜面上接收的孢子，可直接適溫下培養(yǎng)，約1周，待孢子萌發(fā)后，挑取萌發(fā)早、長勢旺的菌落，移接至新斜面上，經(jīng)培養(yǎng)即為母種。

　　野外分離靈芝孢子時因條件限制，可將菌肉（帶菌管）貼在試管壁上，待孢子彈射入培養(yǎng)基后及時轉(zhuǎn)管。

　　孢子萌發(fā)后先形成一級菌絲，幾天后便可形成二級菌絲。如果在顯微鏡下觀察到鎖狀聯(lián)合，一般可確定為得到了靈芝菌絲。

　　孢子分離得到的菌種，由于其變異性較大，所以不應(yīng)直接用于大面積生產(chǎn)，而是選擇具有該品種其優(yōu)良性狀的后代進(jìn)行組織分離后再用于生產(chǎn)。