第三節(jié)　　菌種分離

　　菌種分離即是進(jìn)行蘑菇菌絲的純化過程，它是制種工作的重要環(huán)節(jié)，通俗講是把蘑菇菌絲從自然界中單獨(dú)分離出來進(jìn)行純培養(yǎng)，從而獲得純蘑菇菌絲生長的菌種。蘑菇菌種的分離方法有三種：即孢子分離、組織分離和基質(zhì)菌絲分離法。

一、孢子分離法

　　蘑菇孢子分離法，是利用成熟子實(shí)體的有性擔(dān)孢子能自動(dòng)從子實(shí)體層中彈射出來的特征，在無菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上，使孢子萌發(fā)成菌絲，獲得純種的一種方法。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔(dān)孢子（是指其細(xì)胞核已經(jīng)地核配過程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應(yīng)用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個(gè)步驟，首先是采集孢子，其次進(jìn)行單孢或多孢子分離。

（一）采集孢子

１、種菇的選擇　采集孢子首先要選好種菇即分離用的子實(shí)體。一般蘑菇種菇要求是第一潮菇，出菇較早，單生，個(gè)體健壯，特征典型的子實(shí)體，經(jīng)過仔細(xì)的觀察篩選后在菇床上做個(gè)記號(hào)，讓種菇充分生長，直至即將破膜時(shí)將菇采摘進(jìn)行孢子彈射。

２、孢子彈射收集　種菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次，再用無菌濾紙把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進(jìn)行表面消毒。隨后用無菌刀切掉多余菌柄（約留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖　所示）。這套孢子收集裝置需事先進(jìn)行高壓滅菌消毒。把裝好子實(shí)體的孢子彈射收集器放在溫度為15-20℃的室內(nèi),經(jīng)24-48小時(shí)左右， 可見到無菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。在無菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無菌的空試管中，并在溫度下進(jìn)行真空干燥，之后放入冰箱可長期保存?zhèn)溆谩?p> （二）孢子分離

１、多孢分離法　即把多個(gè)孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長交錯(cuò)在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個(gè)孢子間的種性互補(bǔ)，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性，此法比較簡易，在過去的蘑菇制種中應(yīng)用較為普遍。

（１）斜面劃線法：按無菌操作規(guī)程，用無菌接種環(huán)從收到孢子的濾紙條上沾取少量孢子，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上自下而上劃線，劃線時(shí)勿用力， 以免劃破培養(yǎng)基表面，接種完畢，抽出接種種灼燒試管口，塞上棉塞，放置24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后（一般約15-20天），挑選萌發(fā)快，長勢旺的菌落， 轉(zhuǎn)接于新試管培養(yǎng)基上再行培養(yǎng)。

（２）涂布分離法：按無菌操作方法，取一小塊具有孢子的濾紙條，放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液，然后用已滅菌的試管，吸取孢子懸浮液，滴1-2滴到PDA試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。孢子在培養(yǎng)基上經(jīng)24℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)后，挑選幾株發(fā)育勻稱，生長速度快的菌落，移接于另一試管斜面培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)即為母種。

２、單孢分離　就是將采集到的孢子群單個(gè)分開進(jìn)行培養(yǎng)，讓它單獨(dú)萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。

（１）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個(gè)孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落，其步驟如下：

①制備無菌水試管:取10支試管,其中1支裝100毫升蒸餾水,其它9支裝9毫升蒸餾水,經(jīng)高壓滅菌即成無菌水。

②制孢子懸液：取一小塊收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無菌水試管中, 搖振使孢子分散成懸液,用無菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中, 搖振使其分期,再從第2支試管中吸取1毫升注入第3支試管中, 如此反復(fù)稀釋直到孢子濃度達(dá)到300-500個(gè)孢子/毫升,備用。

③制培養(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基,裝入三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌, 準(zhǔn)備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過高壓滅菌備用,待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時(shí),在無菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿放平,晝使培養(yǎng)基表面光滑,厚度一致。

④孢子涂布：在無菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上,使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上,蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿,放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

⑤挑選單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過５天的培養(yǎng)開始萌發(fā)長出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個(gè)孢子萌發(fā)成長而成的，可使用打孔器進(jìn)行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。 打孔器的外徑應(yīng)小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會(huì)觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。

（２）毛細(xì)管法：孢子懸浮液經(jīng)過稀釋，使用毛細(xì)滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi)，晝使每一滴只含有一個(gè)孢子，從而達(dá)到單孢子分離，其方法如下：

①孢子懸浮液制備同稀釋分離法，孢子濃度控制在200-300個(gè)孢子/毫升。

②毛細(xì)滴管制備:取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細(xì)管, 稍冷卻后再加熱并迅速拉長,使管尖內(nèi)徑約200微米,剪斷即成毛細(xì)滴管,在滴管后端塞棉花, 裝入消毒盒中后進(jìn)行滅菌備用。

③點(diǎn)樣鏡檢：用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴),在無菌操作下,快速點(diǎn)于皿蓋內(nèi)壁的標(biāo)記圈中央,滴液應(yīng)小于低倍鏡的視野, 點(diǎn)樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上,貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴,確定是單孢者,即在皿蓋上標(biāo)上記號(hào)。

④培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標(biāo)記為單孢子的液滴,使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個(gè)皿蓋對(duì)接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣),這樣就形成一個(gè)刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室,置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng),待單孢子萌發(fā),及時(shí)撕下膠布,用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊,移接到新鮮PDA斜面試管中,置24℃恒溫箱中培養(yǎng),即可區(qū)得單孢純種。

（３）器械分離法：應(yīng)用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至PDA 平板中進(jìn)行孢子刺激萌發(fā)培養(yǎng),獲得單孢純種。

①孢子懸浮液制備：同稀釋分離法，孢子濃度控制在1000個(gè)/毫升;

②平板涂布:將稀釋后的孢子懸浮液滴0.1毫升于平板上,用無菌的T氏棒進(jìn)行均勻涂布,每個(gè)平板含孢子大約100個(gè)左右;

③鏡檢分離:待涂布均勻的平板瓊脂表面水分干燥后即可于顯微鏡下觀察,當(dāng)在視野中心見到孢子,而視野周圍無其它孢子時(shí),可用顯微操作器操縱玻璃針把孢子從培養(yǎng)基表面挑取,隨后把孢子轉(zhuǎn)移至PDA平板的表面上,進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng),孢子萌發(fā)培養(yǎng)須使用蘑菇氣生菌絲刺激培養(yǎng),才能提高萌發(fā)率,培養(yǎng)的具體操作方法與涂布分離法相同。

（４）單孢子菌落接待：當(dāng)孢子經(jīng)過10天的刺激培養(yǎng), 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落,應(yīng)及時(shí)用打孢子器把該菌落分離,每天都應(yīng)觀察孢子萌發(fā)情況, 如果不及時(shí)把菌落移接,該菌落會(huì)快速生長而影響較遲萌發(fā)單孢子的分離。

二、組織分離法

　　組織分離法是利用子實(shí)體組織來分離獲得純菌絲的方法。組織分離系一種無性繁殖法，雙親的染色體沒有經(jīng)過重組，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡便，取村廣泛，在過去傳統(tǒng)的穩(wěn)定菌株中常采用此方法進(jìn)行菌種的分離，退化不明顯，但是隨著蘑菇雜交菌種的應(yīng)用，由于雜種本身所具有的不穩(wěn)定，組織分離常造成菌株的退化，目前生產(chǎn)上很少采用，只是進(jìn)行野生菌株分離時(shí)，才比較常用。其方法如下：

①挑選種菇：其標(biāo)準(zhǔn)與孢子收集要求相同；

②菇體消毒：將子實(shí)體菌柄基部切除,置接種箱內(nèi),用75%酒精對(duì)菇體表面進(jìn)行消毒;

③組織分離:解剖刀經(jīng)火焰滅菌,在菇柄中部縱切一刀, 用手掰開菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個(gè)小方塊,隨后挑取一小塊組織,迅速移接到PDA斜面培養(yǎng)基上,置24℃下培養(yǎng),待組織塊長出菌絲無污染即為純種。