研究了雞腿蘑(Coprinus comatus)黑斑病的發(fā)生情況、癥狀及病原菌的分離、培養(yǎng)、回接、鑒定等,證實(shí)輪枝孢霉(Verticillium sp.)是引起雞腿蘑黑斑病的病原菌。
雞腿蘑;A黑斑病;A癥狀;A病原;A輪枝孢霉
雞腿蘑(Coprinus comatus)又名毛頭鬼傘、毛鬼傘、刺蘑菇,隸屬于真菌門(mén)(Eumycophyta),擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),傘菌目(Agaricales),鬼傘科(Coprinaceae),鬼傘屬 (Coprinus)。雞腿蘑子實(shí)體味道鮮美,是一種食、藥兼用蕈菌,深受消費(fèi)者的歡迎,在國(guó)際、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求量大。由于栽培雞腿蘑的經(jīng)濟(jì)效益高,近年來(lái),我國(guó)的雞腿蘑產(chǎn)量逐年上升。但隨著栽培年限的延長(zhǎng),特別是設(shè)施周年栽培的普及,病蟲(chóng)害問(wèn)題逐年加重。 2004年,我們?cè)谏綎|省長(zhǎng)清、平陰、東平等地發(fā)現(xiàn)了一種雞腿蘑新病害——黑斑病。該病發(fā)病快、傳染性強(qiáng)、危害嚴(yán)重,影響了雞腿蘑的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。因此,我們對(duì)雞腿蘑黑斑病發(fā)生的癥狀和病原菌的顯微形態(tài)進(jìn)行了調(diào)查研究,旨在明確該病的病原菌、并為雞腿蘑黑斑病的有效防治提供技術(shù)支持。
1 材料和方法
1.1ρ本采集
試驗(yàn)樣本于2005年7月下旬采自山東省長(zhǎng)清崮山鎮(zhèn)一山洞栽培的雞腿蘑出菇現(xiàn)場(chǎng)。該栽培洞溫度偏高(22 ℃左右),頂部及四壁滴滲水,空氣濕度大,通風(fēng)條件差。該病同批發(fā)生面積大(約6000 O),發(fā)病率在70%以上,發(fā)病快、危害嚴(yán)重且傳染性極強(qiáng),難于控制其蔓延。試驗(yàn)樣本為感染黑斑病的雞腿蘑頭潮子實(shí)體,多點(diǎn)取樣采集病菇樣本后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化培養(yǎng)。
1.2Σ≡菌分離純化
1.2.1ε嘌基
復(fù)合PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,麥麩30 g(濾汁),葡萄糖20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氫鉀2 g,硫酸鎂1 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL。
酸化復(fù)合PDA培養(yǎng)基:復(fù)合PDA培養(yǎng)基滅菌后,每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL乳酸(山東省萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠生產(chǎn)的分析純,C2H6O3含量85%~99%)酸化,用于病原菌分離。
1.2.2Σ≡菌分離方法
參照方中達(dá)的組織分離法[1]。將感病子實(shí)體縱刨,夾取病健交界處大約2~3 mm2的一小塊菌肉組織,置于分離培養(yǎng)基平板上,共分離30塊組織塊(每點(diǎn)分離2~3塊),25 ℃培養(yǎng)5 d,連續(xù)純化2~3次得到菌絲組織純培養(yǎng)物,保存于復(fù)合PDA試管斜面上備用。
1.3回接試驗(yàn)
按文獻(xiàn)[1]的方法將分離到的病菌制成孢子懸浮液,噴霧接種到生長(zhǎng)中的健康雞腿蘑子實(shí)體上,對(duì)照噴無(wú)菌水。分離獲得的每個(gè)病菌菌株均為一個(gè)接種處理,每個(gè)處理與對(duì)照均重復(fù)2次,每個(gè)重復(fù)5個(gè)菌筒,接種后于12~21 ℃、空氣相對(duì)濕度90%培養(yǎng)5 d,觀察雞腿蘑子實(shí)體的發(fā)病情況。
1.4Σ≡菌顯微鑒定
將分離得到的原病原菌和回接試驗(yàn)分離得到的病原菌分別接種于復(fù)合PDA平板上, 25 ℃培養(yǎng)7 d后,觀察平板上的菌落生長(zhǎng)形態(tài);在Olympus AO-120顯微鏡下(600×)檢測(cè)病原菌菌絲及分生孢子形態(tài)。
2 結(jié)果與分析
2.1Σ『χ⒆刺氐
雞腿蘑黑斑病發(fā)病初期,菌蕾或幼菇表面可見(jiàn)一層白粉狀病原菌,之后菌蓋上出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn),并逐漸擴(kuò)大,病斑中心凹陷、色澤變深,產(chǎn)生灰白色病原物,后期形成較多粉狀孢子。幼菇發(fā)病后可繼續(xù)生長(zhǎng),但發(fā)育不良,色澤灰白,病斑部位質(zhì)地較干,局限于菌蓋表層組織。隨著菇體生長(zhǎng)和病斑發(fā)展,子實(shí)體多呈畸形,菌蓋短薄,病斑部位開(kāi)裂干腐,后期菌柄受感染,上部外層組織剝裂,表面粗糙,產(chǎn)生黑斑,菌肉由外向內(nèi)變污白至黃褐色,病菇腐爛速度較慢,一般不濕腐,不分泌褐色汁液,無(wú)特殊臭味。病菌侵染由外向內(nèi),病菇整體很快變黑褐,失去商品價(jià)值。該病在菇房中傳染性極強(qiáng),一叢菇體中若有一個(gè)子實(shí)體菌蓋開(kāi)始發(fā)病,很快便傳染到菇叢中的其它菇或鄰近菇叢,最后造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。雞腿蘑黑斑病癥狀見(jiàn)圖1。
2.2Σ≡菌分離、回接與確認(rèn)
從30塊組織塊中,共分離獲得16株相同的病原菌菌株(有12塊長(zhǎng)出單一的病原菌,有4塊同時(shí)長(zhǎng)出了雞腿蘑菌絲和病原菌,其余14塊均只長(zhǎng)出雞腿蘑菌絲),病原菌檢出率為53.3%,未檢出其它雜菌。將16個(gè)病菌菌株重新回接到健康的雞腿蘑子實(shí)體上,結(jié)果16個(gè)菌株均引起雞腿蘑子實(shí)體出現(xiàn)黑斑,與菇房自然發(fā)病癥狀相同,而對(duì)照子實(shí)體生長(zhǎng)正常,無(wú)任何癥狀。從發(fā)病子實(shí)體上可以重新分離到病原菌,其培養(yǎng)性狀與接種菌株完全一致,表明該病原菌為引起雞腿蘑黑斑病的病原菌。
2.3Σ≡菌的形態(tài)鑒定
在復(fù)合PDA培養(yǎng)基平板上,病原菌菌落呈淡白色,密氈狀,表面有放射狀皺折,中央微隆起(圖2)。顯微鏡檢表明,病原菌分生孢子梗直立,輪生,有3~4個(gè)分枝,頂層小梗下部膨大,頂端尖細(xì),梗長(zhǎng)20~25 μm,分生孢子單生于小梗頂端,無(wú)色,單細(xì)胞,大小2.0~2.5 μm×3.5~6.0 μm。菌絲分枝,有隔,直徑2.5 μm左右(圖3)。初步確定該病原菌為輪枝孢霉(Verticillium sp.),隸屬于真菌門(mén) (Eumycophyta),半知菌亞門(mén) (Deuteromycotina),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),輪枝孢屬 (Verticillium)[2]。
3 討論
通過(guò)對(duì)雞腿蘑感病子實(shí)體的分離、回接驗(yàn)證及顯微鏡形態(tài)觀察,初步證明雞腿蘑黑斑病是由輪枝孢霉(Verticillium sp.)侵染引起的。據(jù)報(bào)道,危害食用菌——蘑菇(Agaricus bisporus)、平菇(Pleurotus ostreatus)、金針菇(Flammulina velutipes)的輪枝孢霉主要是菌生輪枝霉(V. fungicola Hassebr.,即V. malthouosei Ware),菌褶輪枝霉(V. lamellicola W. Gams)和蘑菇輪枝霉(V. psalliotae Tresch)。對(duì)該病的防治除了嚴(yán)格菇房環(huán)境消毒外,苯丙咪唑類藥物的防治效果較好,但有些地區(qū)的輪枝孢霉對(duì)苯丙咪唑類藥物已產(chǎn)生抗性[3,4]。本試驗(yàn)分離到的雞腿蘑黑斑病病原菌具體屬于輪枝孢霉的哪一個(gè)種還有待進(jìn)一步鑒定。
此外,為了控制雞腿蘑黑斑病的發(fā)生、發(fā)展和危害,還須對(duì)該病進(jìn)行系統(tǒng)研究,以明確病原菌的生物學(xué)特性、侵染途徑、流行機(jī)制,并進(jìn)行雞腿蘑抗病品種篩選,以及制定綜合防治技術(shù),遏制該病的發(fā)生蔓延,保證雞腿蘑及其它食用菌生產(chǎn)的健康安全發(fā)展。お
參考文獻(xiàn) （略）
文章作者：黃春燕 萬(wàn)魯長(zhǎng) 單洪濤 郭惠東 張柏松 文章來(lái)源：《食用菌學(xué)報(bào)》 2008年第01期
雞腿蘑;A黑斑病;A癥狀;A病原;A輪枝孢霉
雞腿蘑(Coprinus comatus)又名毛頭鬼傘、毛鬼傘、刺蘑菇,隸屬于真菌門(mén)(Eumycophyta),擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),傘菌目(Agaricales),鬼傘科(Coprinaceae),鬼傘屬 (Coprinus)。雞腿蘑子實(shí)體味道鮮美,是一種食、藥兼用蕈菌,深受消費(fèi)者的歡迎,在國(guó)際、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求量大。由于栽培雞腿蘑的經(jīng)濟(jì)效益高,近年來(lái),我國(guó)的雞腿蘑產(chǎn)量逐年上升。但隨著栽培年限的延長(zhǎng),特別是設(shè)施周年栽培的普及,病蟲(chóng)害問(wèn)題逐年加重。 2004年,我們?cè)谏綎|省長(zhǎng)清、平陰、東平等地發(fā)現(xiàn)了一種雞腿蘑新病害——黑斑病。該病發(fā)病快、傳染性強(qiáng)、危害嚴(yán)重,影響了雞腿蘑的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。因此,我們對(duì)雞腿蘑黑斑病發(fā)生的癥狀和病原菌的顯微形態(tài)進(jìn)行了調(diào)查研究,旨在明確該病的病原菌、并為雞腿蘑黑斑病的有效防治提供技術(shù)支持。
1 材料和方法
1.1ρ本采集
試驗(yàn)樣本于2005年7月下旬采自山東省長(zhǎng)清崮山鎮(zhèn)一山洞栽培的雞腿蘑出菇現(xiàn)場(chǎng)。該栽培洞溫度偏高(22 ℃左右),頂部及四壁滴滲水,空氣濕度大,通風(fēng)條件差。該病同批發(fā)生面積大(約6000 O),發(fā)病率在70%以上,發(fā)病快、危害嚴(yán)重且傳染性極強(qiáng),難于控制其蔓延。試驗(yàn)樣本為感染黑斑病的雞腿蘑頭潮子實(shí)體,多點(diǎn)取樣采集病菇樣本后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化培養(yǎng)。
1.2Σ≡菌分離純化
1.2.1ε嘌基
復(fù)合PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,麥麩30 g(濾汁),葡萄糖20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氫鉀2 g,硫酸鎂1 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL。
酸化復(fù)合PDA培養(yǎng)基:復(fù)合PDA培養(yǎng)基滅菌后,每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL乳酸(山東省萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠生產(chǎn)的分析純,C2H6O3含量85%~99%)酸化,用于病原菌分離。
1.2.2Σ≡菌分離方法
參照方中達(dá)的組織分離法[1]。將感病子實(shí)體縱刨,夾取病健交界處大約2~3 mm2的一小塊菌肉組織,置于分離培養(yǎng)基平板上,共分離30塊組織塊(每點(diǎn)分離2~3塊),25 ℃培養(yǎng)5 d,連續(xù)純化2~3次得到菌絲組織純培養(yǎng)物,保存于復(fù)合PDA試管斜面上備用。
1.3回接試驗(yàn)
按文獻(xiàn)[1]的方法將分離到的病菌制成孢子懸浮液,噴霧接種到生長(zhǎng)中的健康雞腿蘑子實(shí)體上,對(duì)照噴無(wú)菌水。分離獲得的每個(gè)病菌菌株均為一個(gè)接種處理,每個(gè)處理與對(duì)照均重復(fù)2次,每個(gè)重復(fù)5個(gè)菌筒,接種后于12~21 ℃、空氣相對(duì)濕度90%培養(yǎng)5 d,觀察雞腿蘑子實(shí)體的發(fā)病情況。
1.4Σ≡菌顯微鑒定
將分離得到的原病原菌和回接試驗(yàn)分離得到的病原菌分別接種于復(fù)合PDA平板上, 25 ℃培養(yǎng)7 d后,觀察平板上的菌落生長(zhǎng)形態(tài);在Olympus AO-120顯微鏡下(600×)檢測(cè)病原菌菌絲及分生孢子形態(tài)。
2 結(jié)果與分析
2.1Σ『χ⒆刺氐
雞腿蘑黑斑病發(fā)病初期,菌蕾或幼菇表面可見(jiàn)一層白粉狀病原菌,之后菌蓋上出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn),并逐漸擴(kuò)大,病斑中心凹陷、色澤變深,產(chǎn)生灰白色病原物,后期形成較多粉狀孢子。幼菇發(fā)病后可繼續(xù)生長(zhǎng),但發(fā)育不良,色澤灰白,病斑部位質(zhì)地較干,局限于菌蓋表層組織。隨著菇體生長(zhǎng)和病斑發(fā)展,子實(shí)體多呈畸形,菌蓋短薄,病斑部位開(kāi)裂干腐,后期菌柄受感染,上部外層組織剝裂,表面粗糙,產(chǎn)生黑斑,菌肉由外向內(nèi)變污白至黃褐色,病菇腐爛速度較慢,一般不濕腐,不分泌褐色汁液,無(wú)特殊臭味。病菌侵染由外向內(nèi),病菇整體很快變黑褐,失去商品價(jià)值。該病在菇房中傳染性極強(qiáng),一叢菇體中若有一個(gè)子實(shí)體菌蓋開(kāi)始發(fā)病,很快便傳染到菇叢中的其它菇或鄰近菇叢,最后造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。雞腿蘑黑斑病癥狀見(jiàn)圖1。
2.2Σ≡菌分離、回接與確認(rèn)
從30塊組織塊中,共分離獲得16株相同的病原菌菌株(有12塊長(zhǎng)出單一的病原菌,有4塊同時(shí)長(zhǎng)出了雞腿蘑菌絲和病原菌,其余14塊均只長(zhǎng)出雞腿蘑菌絲),病原菌檢出率為53.3%,未檢出其它雜菌。將16個(gè)病菌菌株重新回接到健康的雞腿蘑子實(shí)體上,結(jié)果16個(gè)菌株均引起雞腿蘑子實(shí)體出現(xiàn)黑斑,與菇房自然發(fā)病癥狀相同,而對(duì)照子實(shí)體生長(zhǎng)正常,無(wú)任何癥狀。從發(fā)病子實(shí)體上可以重新分離到病原菌,其培養(yǎng)性狀與接種菌株完全一致,表明該病原菌為引起雞腿蘑黑斑病的病原菌。
2.3Σ≡菌的形態(tài)鑒定
在復(fù)合PDA培養(yǎng)基平板上,病原菌菌落呈淡白色,密氈狀,表面有放射狀皺折,中央微隆起(圖2)。顯微鏡檢表明,病原菌分生孢子梗直立,輪生,有3~4個(gè)分枝,頂層小梗下部膨大,頂端尖細(xì),梗長(zhǎng)20~25 μm,分生孢子單生于小梗頂端,無(wú)色,單細(xì)胞,大小2.0~2.5 μm×3.5~6.0 μm。菌絲分枝,有隔,直徑2.5 μm左右(圖3)。初步確定該病原菌為輪枝孢霉(Verticillium sp.),隸屬于真菌門(mén) (Eumycophyta),半知菌亞門(mén) (Deuteromycotina),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),輪枝孢屬 (Verticillium)[2]。
3 討論
通過(guò)對(duì)雞腿蘑感病子實(shí)體的分離、回接驗(yàn)證及顯微鏡形態(tài)觀察,初步證明雞腿蘑黑斑病是由輪枝孢霉(Verticillium sp.)侵染引起的。據(jù)報(bào)道,危害食用菌——蘑菇(Agaricus bisporus)、平菇(Pleurotus ostreatus)、金針菇(Flammulina velutipes)的輪枝孢霉主要是菌生輪枝霉(V. fungicola Hassebr.,即V. malthouosei Ware),菌褶輪枝霉(V. lamellicola W. Gams)和蘑菇輪枝霉(V. psalliotae Tresch)。對(duì)該病的防治除了嚴(yán)格菇房環(huán)境消毒外,苯丙咪唑類藥物的防治效果較好,但有些地區(qū)的輪枝孢霉對(duì)苯丙咪唑類藥物已產(chǎn)生抗性[3,4]。本試驗(yàn)分離到的雞腿蘑黑斑病病原菌具體屬于輪枝孢霉的哪一個(gè)種還有待進(jìn)一步鑒定。
此外,為了控制雞腿蘑黑斑病的發(fā)生、發(fā)展和危害,還須對(duì)該病進(jìn)行系統(tǒng)研究,以明確病原菌的生物學(xué)特性、侵染途徑、流行機(jī)制,并進(jìn)行雞腿蘑抗病品種篩選,以及制定綜合防治技術(shù),遏制該病的發(fā)生蔓延,保證雞腿蘑及其它食用菌生產(chǎn)的健康安全發(fā)展。お
參考文獻(xiàn) （略）
文章作者：黃春燕 萬(wàn)魯長(zhǎng) 單洪濤 郭惠東 張柏松 文章來(lái)源：《食用菌學(xué)報(bào)》 2008年第01期
