《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技》 2008年第08期 作者：武模戈
摘要 利用拮抗試驗、同工酶技術(shù)以及菌絲平板培養(yǎng)研究了14個平菇菌株的親緣關(guān)系和培養(yǎng)特性。對親緣關(guān)系研究的結(jié)果表明：14個栽培菌株分別屬于4個品種，其中P1、P2、P5 親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P3、P6、P11親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P4與所有供試菌株都發(fā)生拮抗反應(yīng)，為獨立品種。菌絲培養(yǎng)結(jié)果表明：P11生長速度最快，平均生長速度達到5.19mm/d，其次是P7、P6，分別為5.04mm/d和4.96mm/d，與其他菌株的差異達到極顯著水平；P9最慢，平均生長速度達到2.23mm/d；P13、P8的生長速度分別為2.30mm/d和2.53mm/d，與其他菌株的差異也達到顯著水平。綜合不同菌株菌絲的生長速度和生長勢，潛在的優(yōu)良品種初步確定為P11、P7、P6、P14、P1和P10。
關(guān)鍵詞 平菇；拮抗反應(yīng)；酯酶同工酶；電泳；生長速度；生長勢
中圖分類號 S646.1+4文獻標識碼A文章編號1007-5739（2008）08-0005-03
平菇（Pleurotus ostreatus）在分類學上屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]。全世界約有50種，我國是側(cè)耳屬真菌種類資源較為豐富的國家之一[2]。由于我國菌種管理制度不完善，加之管理力度不夠，目前菌種生產(chǎn)、銷售比較混亂。在大量的推廣菌株中，存在著嚴重的同種異名現(xiàn)象，品種質(zhì)量參差不齊[3]。菌種管理混亂給菇農(nóng)引種和研究單位進行育種研究帶來諸多不便，制約了平菇生產(chǎn)的健康發(fā)展。對在我省大面積推廣的14個平菇菌株進行了拮抗試驗、菌絲培養(yǎng)特性試驗和出菇試驗，以明確各菌株間的親緣關(guān)系，選出適宜于本地區(qū)栽培平菇優(yōu)良菌株，同時為今后進行雜交育種時親本的選擇奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株。供試菌株及其來源見表1。
1.1.2儀器與設(shè)備。BCM-1000生物潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司制造）、101-1-BS恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠制造）、SPX-250型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠制造）、電爐（上海中航五金機械廠制造）、培養(yǎng)皿（西安延河玻璃儀器廠制造）、試管、培養(yǎng)皿、接種鉤、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、玻璃板、鐵夾、注射器、電泳儀、電泳槽、有機玻璃條、容量瓶、試劑瓶、燒杯、移液管、吸耳球、滴管、玻璃圓盤、電冰箱、酸度計等。
1.1.3供試培養(yǎng)基。綜合PDA培養(yǎng)基：配方為馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。液體PD培養(yǎng)基：水1 000 mL、馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g。
1.2方法
1.2.1菌種活化與同步。將供試菌株在母種培養(yǎng)基上活化，再將活化后的菌種接種到綜合PDA培養(yǎng)基上平板中央，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)7d，以保證后期試驗中菌齡和接種量一致，減少試驗誤差。
1.2.2拮抗試驗[4]。將14個供試菌株中的任意2個菌株配對組合，進行對峙培養(yǎng)，分別接種于綜合PDA平板上，每皿接2個菌株，菌種塊相距2.5cm，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應(yīng)。
1.2.3菌絲培養(yǎng)特性試驗。將綜合PDA培養(yǎng)基在微波爐中溶化，倒平板，在無菌條件下進行接種。接種時用直徑6mm的打孔器沿活化后的菌種菌落邊緣取相同菌齡的菌種塊，分別接種在平板培養(yǎng)基中央，每皿接直徑6mm的菌種1塊，菌絲面朝上，輕壓以防止滑動。每個品種設(shè)3個重復。接種后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長情況，當生長速度最快的菌株即將長滿平板時取出，觀察比較菌絲生長勢，測定菌落直徑，計算菌絲生長速度[6]。
菌絲生長速度（mm/d）=（平均菌落直徑-6）/（菌絲培養(yǎng)天數(shù)×2）
1.2.4同工酶電泳[5-6]。同工酶是指具有相同或相似的催化功能但酶分子的結(jié)構(gòu)卻不同的一組酶，一般認為同工酶是由染色體上不同的等位基因或不同基因座位編碼的，它所表達的信息是分子水平上的信息。同工酶分析作為分子遺傳標記技術(shù)之一，不僅被廣泛用于動植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學分類的重要指標引進真菌的分類鑒定研究中，它彌補了菌落形態(tài)與顏色、孢子形態(tài)、子實體形態(tài)等特征傳統(tǒng)真菌分類的不足，且簡單易行，已逐漸成為該領(lǐng)域常用而重要的工具，特別是在屬內(nèi)種間以及品種之間的分類鑒定中是非常有效的。近年來，許多學者在利用同工酶技術(shù)進行食用菌育種和遺傳分析上作了大量工作，本試驗應(yīng)用同工酶技術(shù)研究平菇14個菌株的酯酶酶譜相似性和差異性，并對14個菌株進行親緣關(guān)系分析，為平菇分類、育種和平菇優(yōu)劣的鑒定提供分子水平的依據(jù)。
1.2.4.1平菇菌絲液體培養(yǎng)。將活化后生長旺盛的菌絲分別接種于250mL裝有80mL無菌PD液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，25℃恒溫搖床培養(yǎng)7d，形成球狀菌絲團。
1.2.4.2酶提取液的制備。從上述三角瓶中濾出菌絲，用蒸餾水沖洗2～3次，洗凈其上培養(yǎng)基，離心，吸干水分，放入無菌的培養(yǎng)皿冰箱內(nèi)冷凍24h后，加入與菌絲等重量的0.1 mol/L TBE緩沖液在冰浴上用研缽充分研磨菌絲成糊狀，在10 000rpm條件下離心10min，取上清液，加入少量甘油置冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4.3電泳[7]。電泳最好在4℃左右進行，這樣一方面可以防止電泳發(fā)熱影響酶活力，另一方面可防止膠面斷裂等問題發(fā)生。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，pH值8.9；濃縮膠濃度3%，pH值6.7；電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)，pH值8.3，點樣量0.02mL，電泳指示劑為溴酚藍，開始電泳采用100V的電壓，待溴酚藍進入分離膠后，加大電壓至160V，當溴酚藍距膠板底部1cm時，停止電泳。電泳結(jié)束后，取下膠板，放入酯酶染色液中，37℃下染色30min，待顯出清晰酶帶后取出，用蒸餾水漂洗數(shù)次，用7%醋酸固定脫色后，進行拍照并進行酶譜分析。
（1）制板。將玻璃板先用肥皂洗凈，再用酒精擦1遍，晾干后待用。
?。?）分離膠灌膠。將配制好的分離膠倒入固定好的玻璃板中，灌至距玻璃板凹槽3cm處，注入蒸餾水壓平膠面。凝固大約30min。
?。?）隔層膠灌膠。待分離膠凝固，與蒸餾水之間形成1條清楚的界面。將水倒出，用濾紙吸去多余的水，將配制好的隔層膠溶液倒入玻璃板，離凹槽3mm處，插入試樣格，防止產(chǎn)生氣泡。凝固大約40min。
?。?）去試樣格。兩手拇指扣住試樣格的柄，兩手的食指和中指分別壓住玻璃板的邊緣，慢慢取出試樣格。用濾紙吸去樣品槽中多余的水分。去掉底部的有機玻璃條，吸去多余的水分。
?。?）裝板。用鐵夾將玻璃板固定在電泳槽上，向電泳槽的下槽倒入電泳緩沖液，趕走氣泡。用藍色記號筆標記加樣品的位置，記好順序。
?。?）加樣。在相應(yīng)的試樣槽中，加入20μL樣品、5mL 0.2％的溴酚藍指示劑和5mL的電泳緩沖液。
?。?）電泳。在4℃條件下，以160V的電壓、15A的電流進行電泳，當溴酚藍距膠板底部1cm時，停止電泳。
摘要 利用拮抗試驗、同工酶技術(shù)以及菌絲平板培養(yǎng)研究了14個平菇菌株的親緣關(guān)系和培養(yǎng)特性。對親緣關(guān)系研究的結(jié)果表明：14個栽培菌株分別屬于4個品種，其中P1、P2、P5 親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P3、P6、P11親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P4與所有供試菌株都發(fā)生拮抗反應(yīng)，為獨立品種。菌絲培養(yǎng)結(jié)果表明：P11生長速度最快，平均生長速度達到5.19mm/d，其次是P7、P6，分別為5.04mm/d和4.96mm/d，與其他菌株的差異達到極顯著水平；P9最慢，平均生長速度達到2.23mm/d；P13、P8的生長速度分別為2.30mm/d和2.53mm/d，與其他菌株的差異也達到顯著水平。綜合不同菌株菌絲的生長速度和生長勢，潛在的優(yōu)良品種初步確定為P11、P7、P6、P14、P1和P10。
關(guān)鍵詞 平菇；拮抗反應(yīng)；酯酶同工酶；電泳；生長速度；生長勢
中圖分類號 S646.1+4文獻標識碼A文章編號1007-5739（2008）08-0005-03
平菇（Pleurotus ostreatus）在分類學上屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]。全世界約有50種，我國是側(cè)耳屬真菌種類資源較為豐富的國家之一[2]。由于我國菌種管理制度不完善，加之管理力度不夠，目前菌種生產(chǎn)、銷售比較混亂。在大量的推廣菌株中，存在著嚴重的同種異名現(xiàn)象，品種質(zhì)量參差不齊[3]。菌種管理混亂給菇農(nóng)引種和研究單位進行育種研究帶來諸多不便，制約了平菇生產(chǎn)的健康發(fā)展。對在我省大面積推廣的14個平菇菌株進行了拮抗試驗、菌絲培養(yǎng)特性試驗和出菇試驗，以明確各菌株間的親緣關(guān)系，選出適宜于本地區(qū)栽培平菇優(yōu)良菌株，同時為今后進行雜交育種時親本的選擇奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株。供試菌株及其來源見表1。
1.1.2儀器與設(shè)備。BCM-1000生物潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司制造）、101-1-BS恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠制造）、SPX-250型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠制造）、電爐（上海中航五金機械廠制造）、培養(yǎng)皿（西安延河玻璃儀器廠制造）、試管、培養(yǎng)皿、接種鉤、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、玻璃板、鐵夾、注射器、電泳儀、電泳槽、有機玻璃條、容量瓶、試劑瓶、燒杯、移液管、吸耳球、滴管、玻璃圓盤、電冰箱、酸度計等。
1.1.3供試培養(yǎng)基。綜合PDA培養(yǎng)基：配方為馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。液體PD培養(yǎng)基：水1 000 mL、馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g。
1.2方法
1.2.1菌種活化與同步。將供試菌株在母種培養(yǎng)基上活化，再將活化后的菌種接種到綜合PDA培養(yǎng)基上平板中央，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)7d，以保證后期試驗中菌齡和接種量一致，減少試驗誤差。
1.2.2拮抗試驗[4]。將14個供試菌株中的任意2個菌株配對組合，進行對峙培養(yǎng)，分別接種于綜合PDA平板上，每皿接2個菌株，菌種塊相距2.5cm，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應(yīng)。
1.2.3菌絲培養(yǎng)特性試驗。將綜合PDA培養(yǎng)基在微波爐中溶化，倒平板，在無菌條件下進行接種。接種時用直徑6mm的打孔器沿活化后的菌種菌落邊緣取相同菌齡的菌種塊，分別接種在平板培養(yǎng)基中央，每皿接直徑6mm的菌種1塊，菌絲面朝上，輕壓以防止滑動。每個品種設(shè)3個重復。接種后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長情況，當生長速度最快的菌株即將長滿平板時取出，觀察比較菌絲生長勢，測定菌落直徑，計算菌絲生長速度[6]。
菌絲生長速度（mm/d）=（平均菌落直徑-6）/（菌絲培養(yǎng)天數(shù)×2）
1.2.4同工酶電泳[5-6]。同工酶是指具有相同或相似的催化功能但酶分子的結(jié)構(gòu)卻不同的一組酶，一般認為同工酶是由染色體上不同的等位基因或不同基因座位編碼的，它所表達的信息是分子水平上的信息。同工酶分析作為分子遺傳標記技術(shù)之一，不僅被廣泛用于動植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學分類的重要指標引進真菌的分類鑒定研究中，它彌補了菌落形態(tài)與顏色、孢子形態(tài)、子實體形態(tài)等特征傳統(tǒng)真菌分類的不足，且簡單易行，已逐漸成為該領(lǐng)域常用而重要的工具，特別是在屬內(nèi)種間以及品種之間的分類鑒定中是非常有效的。近年來，許多學者在利用同工酶技術(shù)進行食用菌育種和遺傳分析上作了大量工作，本試驗應(yīng)用同工酶技術(shù)研究平菇14個菌株的酯酶酶譜相似性和差異性，并對14個菌株進行親緣關(guān)系分析，為平菇分類、育種和平菇優(yōu)劣的鑒定提供分子水平的依據(jù)。
1.2.4.1平菇菌絲液體培養(yǎng)。將活化后生長旺盛的菌絲分別接種于250mL裝有80mL無菌PD液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，25℃恒溫搖床培養(yǎng)7d，形成球狀菌絲團。
1.2.4.2酶提取液的制備。從上述三角瓶中濾出菌絲，用蒸餾水沖洗2～3次，洗凈其上培養(yǎng)基，離心，吸干水分，放入無菌的培養(yǎng)皿冰箱內(nèi)冷凍24h后，加入與菌絲等重量的0.1 mol/L TBE緩沖液在冰浴上用研缽充分研磨菌絲成糊狀，在10 000rpm條件下離心10min，取上清液，加入少量甘油置冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4.3電泳[7]。電泳最好在4℃左右進行，這樣一方面可以防止電泳發(fā)熱影響酶活力，另一方面可防止膠面斷裂等問題發(fā)生。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，pH值8.9；濃縮膠濃度3%，pH值6.7；電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)，pH值8.3，點樣量0.02mL，電泳指示劑為溴酚藍，開始電泳采用100V的電壓，待溴酚藍進入分離膠后，加大電壓至160V，當溴酚藍距膠板底部1cm時，停止電泳。電泳結(jié)束后，取下膠板，放入酯酶染色液中，37℃下染色30min，待顯出清晰酶帶后取出，用蒸餾水漂洗數(shù)次，用7%醋酸固定脫色后，進行拍照并進行酶譜分析。
（1）制板。將玻璃板先用肥皂洗凈，再用酒精擦1遍，晾干后待用。
?。?）分離膠灌膠。將配制好的分離膠倒入固定好的玻璃板中，灌至距玻璃板凹槽3cm處，注入蒸餾水壓平膠面。凝固大約30min。
?。?）隔層膠灌膠。待分離膠凝固，與蒸餾水之間形成1條清楚的界面。將水倒出，用濾紙吸去多余的水，將配制好的隔層膠溶液倒入玻璃板，離凹槽3mm處，插入試樣格，防止產(chǎn)生氣泡。凝固大約40min。
?。?）去試樣格。兩手拇指扣住試樣格的柄，兩手的食指和中指分別壓住玻璃板的邊緣，慢慢取出試樣格。用濾紙吸去樣品槽中多余的水分。去掉底部的有機玻璃條，吸去多余的水分。
?。?）裝板。用鐵夾將玻璃板固定在電泳槽上，向電泳槽的下槽倒入電泳緩沖液，趕走氣泡。用藍色記號筆標記加樣品的位置，記好順序。
?。?）加樣。在相應(yīng)的試樣槽中，加入20μL樣品、5mL 0.2％的溴酚藍指示劑和5mL的電泳緩沖液。
?。?）電泳。在4℃條件下，以160V的電壓、15A的電流進行電泳，當溴酚藍距膠板底部1cm時，停止電泳。
