菌種的衰退與復(fù)壯
1.衰退：
菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。
衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。
常見的衰退現(xiàn)象：
菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；
生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；
抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。
代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降。
2、 菌種的復(fù)壯：
使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。
菌種的復(fù)壯措施：
純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）； 通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillus thuringiensis的復(fù)壯） ； 淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）；采用有效的菌種保藏方法。
3、防止菌種衰退的方法：
控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；選擇合適的培養(yǎng)條件；采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；采用有效的菌種保藏方法。
菌種保藏
優(yōu)良的菌種，如保管不好，就會(huì)發(fā)生生活力減弱，雜菌污染等情況。因此，如何能長期保持菌種優(yōu)良的特性，不致衰老和斷種，是很重要的工作。下面介紹的是微生物菌種的保藏方法，食用菌菌種的保藏可以借鑒之：
由于微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，即達(dá)到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，使之在一定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異而又保持生活能力，從而達(dá)到保藏的目的，有的可保藏幾十年或更長時(shí)間。在需要時(shí)再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。
低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。
保藏方法大致可分為以下幾種：
1．傳代培養(yǎng)保藏法
又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。
2．液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。
3．載體保藏法
是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
4．寄主保藏法
用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
5．冷凍保藏法
可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷凍干燥保藏法
先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。
有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。
相關(guān)器材
細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌；
肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；
滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。
操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及其優(yōu)缺點(diǎn)
下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。
1．斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。
保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。
此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。
2．液體石蠟保藏法
?。?）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。
?。?）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕。
?。?）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長）。
此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。
3．濾紙保藏法
?。?）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘。
（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。
?。?）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
?。?）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
?。?）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
?。?）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。
?。?）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。
4．沙土保藏法
?。?）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
?。?）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
（3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
（4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
（5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。
?。?）按一份黃土、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。
（7）抽樣進(jìn)行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌，方可備用。
?。?）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。
?。?）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。
?。?0）放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干。
?。?1）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
?。?2）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
?。?3）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。
5．液氮冷凍保藏法
（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。
?。?）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。
?。?）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
?。?）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。
?。?）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。
6．冷凍干燥保藏法
?。?）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。
?。?）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對(duì)數(shù)生長期，若用對(duì)數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。
?。?）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。
?。?）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。
將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。
?。?）真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。
抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí)，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時(shí)即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達(dá)到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。
此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對(duì)一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對(duì)一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。
1.衰退：
菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。
衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。
常見的衰退現(xiàn)象：
菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；
生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；
抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。
代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降。
2、 菌種的復(fù)壯：
使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。
菌種的復(fù)壯措施：
純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）； 通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillus thuringiensis的復(fù)壯） ； 淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）；采用有效的菌種保藏方法。
3、防止菌種衰退的方法：
控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；選擇合適的培養(yǎng)條件；采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；采用有效的菌種保藏方法。
菌種保藏
優(yōu)良的菌種，如保管不好，就會(huì)發(fā)生生活力減弱，雜菌污染等情況。因此，如何能長期保持菌種優(yōu)良的特性，不致衰老和斷種，是很重要的工作。下面介紹的是微生物菌種的保藏方法，食用菌菌種的保藏可以借鑒之：
由于微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，即達(dá)到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，使之在一定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異而又保持生活能力，從而達(dá)到保藏的目的，有的可保藏幾十年或更長時(shí)間。在需要時(shí)再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。
低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。
保藏方法大致可分為以下幾種：
1．傳代培養(yǎng)保藏法
又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。
2．液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。
3．載體保藏法
是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
4．寄主保藏法
用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
5．冷凍保藏法
可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷凍干燥保藏法
先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。
有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。
相關(guān)器材
細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌；
肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；
滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。
操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及其優(yōu)缺點(diǎn)
下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。
1．斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。
保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。
此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。
2．液體石蠟保藏法
?。?）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。
?。?）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕。
?。?）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長）。
此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。
3．濾紙保藏法
?。?）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘。
（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。
?。?）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
?。?）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
?。?）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
?。?）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。
?。?）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。
4．沙土保藏法
?。?）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
?。?）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
（3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
（4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
（5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。
?。?）按一份黃土、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。
（7）抽樣進(jìn)行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌，方可備用。
?。?）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。
?。?）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。
?。?0）放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干。
?。?1）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
?。?2）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
?。?3）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。
5．液氮冷凍保藏法
（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。
?。?）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。
?。?）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
?。?）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。
?。?）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。
6．冷凍干燥保藏法
?。?）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。
?。?）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對(duì)數(shù)生長期，若用對(duì)數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。
?。?）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。
?。?）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。
將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。
?。?）真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。
抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí)，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時(shí)即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達(dá)到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。
此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對(duì)一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對(duì)一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。
