一、母種的制備
用試管制成斜面培養(yǎng)基，并接種原始試管種（保留種，并用于生產(chǎn)的母種即為生產(chǎn)母種），可用于擴(kuò)接原種。
1．培養(yǎng)基配方
配方一 綜合馬鈴薯培養(yǎng)基
馬鈴薯200克葡萄糖20克磷酸氫二鉀2克硫酸鎂0.5克
維生素B110毫克瓊脂20克水1000毫升PH值自然
配方二 合成培養(yǎng)基
馬鈴薯20克葡萄糖20克磷酸二氫鉀2克蛋白胨10克牛肉膏5克
酵母膏5克硫酸鎂0.8克水1000毫升PH值自然
2．培養(yǎng)基制作方法
先將馬鈴薯洗凈去皮切成簿片，稱取200克，加水1000毫升，煮沸15—20分鐘，用4層紗布過濾，取其濾液并補(bǔ)足水至1000毫升，加入瓊脂20克，再加熱，瓊脂溶化后，再加入其它配方中的藥品。
培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)在培養(yǎng)凝固前進(jìn)行（瓊脂培養(yǎng)基40℃凝固）一般用漏斗，或分裝瓶，下端連接一段軟橡皮管，橡皮管下面再連接一水段玻璃管，在橡皮管上安裝一個止水彈簧夾，分裝時將玻璃管細(xì)口插入試管內(nèi)，但不要碰到管壁，每支試管裝入量為度管長度1/4。裝好后塞上棉塞，每10支試管扎一捆，棉塞上用塑料紙封扎好，用線繩捆扎起來。
3．滅菌
將分裝后的試管扎捆好，放入高壓蒸氣滅菌鍋，在1公斤/厘米壓力下(鍋入溫度達(dá)121℃)滅菌20分鐘,使微生物包括芽子色全部殺死。待壓力降到0度時，慢慢放出鍋內(nèi)氣體，趁培養(yǎng)基沒有凝固時，將試管擺成斜面。
4．接種、培養(yǎng)
通過無菌操作方法將菌種接入試管斜面上，置28℃、3天后將溫度降至24℃繼續(xù)培養(yǎng)，12—15天左右，菌絲長滿整個試管斜面，即成(生產(chǎn))母種。
二、原種的制備
母種接種到原種培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖育種即為原種，原種一般采用廣口瓶或袋裝。
1．培養(yǎng)基配方
配方一 木屑麩皮培養(yǎng)基
闊樹木78%、麩皮20%、糖1%、石膏粉1%、水65%、PH值自然
配方二 棉籽殼木屑混合培養(yǎng)基
棉籽殼90%、糖1%、麩皮5%、過磷酸鈣3%、石膏粉1%、PH值自然
2．拌料與裝袋
選用新鮮無霉變原料，根據(jù)生產(chǎn)所需的數(shù)量，計算配料總量，將麩皮、石膏粉均勻的混合在培養(yǎng)料里，糖和過磷酸鈣溶于水解后，按上述干料量加入水，比例為1：1、3拌勻，培養(yǎng)料含水量60%為宜，含水量以手緊握培養(yǎng)料指縫間有水欲滴為宜。堆悶30分鐘后，裝瓶(袋)。用機(jī)械或人工裝袋稍加壓實(shí)。塑料袋規(guī)格通常為袋寬9厘米，長21厘米，單層厚0.04厘米，在袋口外套入塑料環(huán)，形成象瓶子一樣，然后在袋口內(nèi)塞松緊適宜棉塞、或用牛皮紙包扎好。
原種滅菌方法有兩種，高壓滅菌和常壓滅菌。高壓滅菌又稱加壓蒸氣滅菌，滅菌原理：在高溫(120℃)、高壓(1公斤/厘米2)條件下滅菌2－3小時，將芽孢在內(nèi)的微生物全部殺死。常壓滅菌稱流通蒸氣滅菌，由于滅菌設(shè)備、條件和基本因素的不同，溫度變動在90－103℃之間，其熱力、穿透力不強(qiáng)，在一定溫度下維持足夠時間達(dá)到滅菌目的，通常在100℃下維持8－10小時。
4．接種與培養(yǎng)
不論用接種箱或接種室接種，在接種前，需對接種箱或接種室用0.2%的來蘇水或漂白粉進(jìn)行消毒處理，然后將滅菌過的料瓶(袋)放入接種箱內(nèi)或接種室內(nèi)，用紫外線燈照射30分鐘后，在無菌條件下進(jìn)行接種，或在接種前用煙霧劑密閉薰蒸消毒。即煙霧劑點(diǎn)燃消毒時應(yīng)關(guān)閉門窗。接種室消毒，一間房需點(diǎn)燃3盒50克規(guī)格煙霧劑；接種箱消毒每次僅用重量為40克，但又細(xì)分為20包的其中2包點(diǎn)燃即可(每包2克)。一般18×180厘米，母種試管每支可接4—6瓶(袋)原種。將接種后的菌種瓶(袋)放入發(fā)菌室培養(yǎng)。以培養(yǎng)室溫度22－26℃，相對濕度為80%以下，光線為弱散射光，發(fā)菌期間應(yīng)保持良好的通風(fēng)條件。原種從接種到菌絲長滿瓶(袋)需30—40天。
三、栽培種制備
原種進(jìn)一步擴(kuò)繁，即為栽培種。栽培種一般采用塑料袋制備，規(guī)格為15×33×0.05（厘米），用無棉蓋體封口。一瓶原種可接50瓶（袋）栽培種。栽培種培養(yǎng)基配方及拌料、裝袋、滅菌、接種、發(fā)菌管理與原種用塑料袋制備時一致。
四、菌種質(zhì)量鑒定
菌種質(zhì)量不僅與能否成功發(fā)菌有關(guān)，也關(guān)系到產(chǎn)量和效益，從事木耳栽培必須嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。菌種的質(zhì)量鑒定有兩個方面的含義：一是分離培養(yǎng)的菌種是否是栽培所需種類。二是菌種是否為優(yōu)良菌株。黑木耳菌種正常菌絲應(yīng)潔白，生活力旺盛，發(fā)菌培養(yǎng)45天后，瓶（袋）間自上而下會出現(xiàn)菊花狀或梅花型膠質(zhì)原基，顏色明褐至黑褐色。如果瓶（袋）底積淡黃色液體，或上半部出現(xiàn)黃色粘液，培養(yǎng)基收縮，為過期老化菌種，應(yīng)予淘汰。
如果菌種菌絲僅發(fā)至瓶（袋）1/3－1/2處時出現(xiàn)淡黑色的膠狀耳基，說明菌種早熟，或擴(kuò)大次數(shù)太多，或由于培養(yǎng)室光線過強(qiáng)。若菌絲只長一個角落而不蔓延，可能是培養(yǎng)基太干、過濕或干濕不均引起。若菌絲蔓延停止不前，并有一明顯抑制線，多為雜菌所致。在發(fā)菌過程中，發(fā)現(xiàn)雜菌應(yīng)及時檢出不用。
用試管制成斜面培養(yǎng)基，并接種原始試管種（保留種，并用于生產(chǎn)的母種即為生產(chǎn)母種），可用于擴(kuò)接原種。
1．培養(yǎng)基配方
配方一 綜合馬鈴薯培養(yǎng)基
馬鈴薯200克葡萄糖20克磷酸氫二鉀2克硫酸鎂0.5克
維生素B110毫克瓊脂20克水1000毫升PH值自然
配方二 合成培養(yǎng)基
馬鈴薯20克葡萄糖20克磷酸二氫鉀2克蛋白胨10克牛肉膏5克
酵母膏5克硫酸鎂0.8克水1000毫升PH值自然
2．培養(yǎng)基制作方法
先將馬鈴薯洗凈去皮切成簿片，稱取200克，加水1000毫升，煮沸15—20分鐘，用4層紗布過濾，取其濾液并補(bǔ)足水至1000毫升，加入瓊脂20克，再加熱，瓊脂溶化后，再加入其它配方中的藥品。
培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)在培養(yǎng)凝固前進(jìn)行（瓊脂培養(yǎng)基40℃凝固）一般用漏斗，或分裝瓶，下端連接一段軟橡皮管，橡皮管下面再連接一水段玻璃管，在橡皮管上安裝一個止水彈簧夾，分裝時將玻璃管細(xì)口插入試管內(nèi)，但不要碰到管壁，每支試管裝入量為度管長度1/4。裝好后塞上棉塞，每10支試管扎一捆，棉塞上用塑料紙封扎好，用線繩捆扎起來。
3．滅菌
將分裝后的試管扎捆好，放入高壓蒸氣滅菌鍋，在1公斤/厘米壓力下(鍋入溫度達(dá)121℃)滅菌20分鐘,使微生物包括芽子色全部殺死。待壓力降到0度時，慢慢放出鍋內(nèi)氣體，趁培養(yǎng)基沒有凝固時，將試管擺成斜面。
4．接種、培養(yǎng)
通過無菌操作方法將菌種接入試管斜面上，置28℃、3天后將溫度降至24℃繼續(xù)培養(yǎng)，12—15天左右，菌絲長滿整個試管斜面，即成(生產(chǎn))母種。
二、原種的制備
母種接種到原種培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖育種即為原種，原種一般采用廣口瓶或袋裝。
1．培養(yǎng)基配方
配方一 木屑麩皮培養(yǎng)基
闊樹木78%、麩皮20%、糖1%、石膏粉1%、水65%、PH值自然
配方二 棉籽殼木屑混合培養(yǎng)基
棉籽殼90%、糖1%、麩皮5%、過磷酸鈣3%、石膏粉1%、PH值自然
2．拌料與裝袋
選用新鮮無霉變原料，根據(jù)生產(chǎn)所需的數(shù)量，計算配料總量，將麩皮、石膏粉均勻的混合在培養(yǎng)料里，糖和過磷酸鈣溶于水解后，按上述干料量加入水，比例為1：1、3拌勻，培養(yǎng)料含水量60%為宜，含水量以手緊握培養(yǎng)料指縫間有水欲滴為宜。堆悶30分鐘后，裝瓶(袋)。用機(jī)械或人工裝袋稍加壓實(shí)。塑料袋規(guī)格通常為袋寬9厘米，長21厘米，單層厚0.04厘米，在袋口外套入塑料環(huán)，形成象瓶子一樣，然后在袋口內(nèi)塞松緊適宜棉塞、或用牛皮紙包扎好。
原種滅菌方法有兩種，高壓滅菌和常壓滅菌。高壓滅菌又稱加壓蒸氣滅菌，滅菌原理：在高溫(120℃)、高壓(1公斤/厘米2)條件下滅菌2－3小時，將芽孢在內(nèi)的微生物全部殺死。常壓滅菌稱流通蒸氣滅菌，由于滅菌設(shè)備、條件和基本因素的不同，溫度變動在90－103℃之間，其熱力、穿透力不強(qiáng)，在一定溫度下維持足夠時間達(dá)到滅菌目的，通常在100℃下維持8－10小時。
4．接種與培養(yǎng)
不論用接種箱或接種室接種，在接種前，需對接種箱或接種室用0.2%的來蘇水或漂白粉進(jìn)行消毒處理，然后將滅菌過的料瓶(袋)放入接種箱內(nèi)或接種室內(nèi)，用紫外線燈照射30分鐘后，在無菌條件下進(jìn)行接種，或在接種前用煙霧劑密閉薰蒸消毒。即煙霧劑點(diǎn)燃消毒時應(yīng)關(guān)閉門窗。接種室消毒，一間房需點(diǎn)燃3盒50克規(guī)格煙霧劑；接種箱消毒每次僅用重量為40克，但又細(xì)分為20包的其中2包點(diǎn)燃即可(每包2克)。一般18×180厘米，母種試管每支可接4—6瓶(袋)原種。將接種后的菌種瓶(袋)放入發(fā)菌室培養(yǎng)。以培養(yǎng)室溫度22－26℃，相對濕度為80%以下，光線為弱散射光，發(fā)菌期間應(yīng)保持良好的通風(fēng)條件。原種從接種到菌絲長滿瓶(袋)需30—40天。
三、栽培種制備
原種進(jìn)一步擴(kuò)繁，即為栽培種。栽培種一般采用塑料袋制備，規(guī)格為15×33×0.05（厘米），用無棉蓋體封口。一瓶原種可接50瓶（袋）栽培種。栽培種培養(yǎng)基配方及拌料、裝袋、滅菌、接種、發(fā)菌管理與原種用塑料袋制備時一致。
四、菌種質(zhì)量鑒定
菌種質(zhì)量不僅與能否成功發(fā)菌有關(guān)，也關(guān)系到產(chǎn)量和效益，從事木耳栽培必須嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。菌種的質(zhì)量鑒定有兩個方面的含義：一是分離培養(yǎng)的菌種是否是栽培所需種類。二是菌種是否為優(yōu)良菌株。黑木耳菌種正常菌絲應(yīng)潔白，生活力旺盛，發(fā)菌培養(yǎng)45天后，瓶（袋）間自上而下會出現(xiàn)菊花狀或梅花型膠質(zhì)原基，顏色明褐至黑褐色。如果瓶（袋）底積淡黃色液體，或上半部出現(xiàn)黃色粘液，培養(yǎng)基收縮，為過期老化菌種，應(yīng)予淘汰。
如果菌種菌絲僅發(fā)至瓶（袋）1/3－1/2處時出現(xiàn)淡黑色的膠狀耳基，說明菌種早熟，或擴(kuò)大次數(shù)太多，或由于培養(yǎng)室光線過強(qiáng)。若菌絲只長一個角落而不蔓延，可能是培養(yǎng)基太干、過濕或干濕不均引起。若菌絲蔓延停止不前，并有一明顯抑制線，多為雜菌所致。在發(fā)菌過程中，發(fā)現(xiàn)雜菌應(yīng)及時檢出不用。
