利用可以在人工條件完成整個生活史的蛹蟲草菌種,分離、鑒定了2個蛹蟲草菌株子囊孢子的單孢分離物,對子囊單孢的配對培養(yǎng)和子實體誘導(dǎo)結(jié)果顯示,蛹蟲草具有典型的二極性異宗配合習(xí)性。
子囊菌;A蛹蟲草;A交配型;A異宗配合
蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link]又名北冬蟲夏草,分類學(xué)上屬真菌門(Eumycota),子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes),球殼目(Sphaeriales),麥角菌科(Clavicepitaceae),蟲草屬(Cordyceps)[1]。蟲草屬真菌是一類具有重要藥用和開發(fā)價值的真菌,其中冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.]為我國傳統(tǒng)名貴滋補中藥材,由于野生資源稀少,價格極其昂貴,許多科研單位對其子實體人工培養(yǎng)進行了大量的研究工作,但至今尚未能規(guī)模培養(yǎng)[2~7]。蛹蟲草作為蟲草屬真菌的模式種,具有與冬蟲夏草相似的藥理功效,且人工規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成功,正逐漸成為冬蟲夏草的重要替代品,具有廣闊的市場前景。目前有關(guān)蛹蟲草的研究,主要集中于培養(yǎng)條件選擇、有效成分分析和藥理作用研究上[8~20],對其基本生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究仍較薄弱[21~24],對其交配型的研究幾為空白[25]。
真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式,即該真菌不需要兩個不同來源的菌絲交配,只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級菌絲就可獨立完成有性生活史。同宗配合分成初級同宗配合(primary homothallism)和次級同宗配合(secondary homothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式,即由同一有性孢子萌發(fā)形成的初級菌絲不能獨立完成有性生活史,只有通過兩個不同交配型的有性孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配,才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型的不親和性因子是一對還是兩對,也可分為兩類:具有一對不親和性因子的二極性異宗配合(bipolar heterothallism)和具有兩對不親和性因子的四極性異宗配合(tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言,二極性異宗配合菌的可親和率為50%,而四極性異宗配合菌的可親和率為25%,這是判斷是否二極性或四極性異宗配合的基本依據(jù)。在已研究的擔(dān)子菌中,約有90%的種屬于異宗配合真菌,其中,約有25%為二極性異宗配合真菌,75%為四極性異宗配合真菌[26,27]。而對子囊菌,現(xiàn)有報道種類中同宗配合占較大比例[27],但研究較多的粗糙脈孢菌(Neurospora crrassa)則為典型的二極性異宗配合真菌(A, a)[28] ;由于缺少像擔(dān)子菌中的鎖狀聯(lián)合一樣的簡易判斷標準,子囊菌關(guān)于交配型的研究比較困難而且報道較少。本文利用能在人工條件下完成全部生活史、并能較容易地分離到子囊孢子單孢的蛹蟲草菌種,率先進行了其交配特性的研究,旨在豐富對子囊菌的交配特性的認識,為蟲草屬內(nèi)不同真菌的交配特性研究提供參考。
1 材料與方法
1.1κ匝椴牧
實驗所用的2個蛹蟲草菌株C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9均采自長白山區(qū),為本實驗室在大量分離純化和篩選基礎(chǔ)上獲得的能成功培養(yǎng)出正常子實體的菌株。
1.2ε嘌基
PDA培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL,用于菌種分離和保存;
PDB培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,水1000 mL,用菌種液體培養(yǎng);
米飯培養(yǎng)基:25 g大米加35 g水,高壓滅菌后作為子實體培養(yǎng)基。
高新華:蛹蟲草(Cordyceps militaris)的交配型研究
1.3ψ郵堤迦斯づ嘌方法
將在PDA斜面活化的蛹蟲草菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中(75 mL/250 mL),轉(zhuǎn)速150 rpm、25 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d,再將所得的液體菌種稀釋(約100倍)轉(zhuǎn)接于瓶裝米飯培養(yǎng)基上(4 mL/瓶),瓶蓋中墊上濾紙,以避免空氣交換可能引發(fā)的污染,于25 ℃暗培養(yǎng)3~4 d,當(dāng)觀察到菌絲已明顯在培養(yǎng)基表面開始蔓延時,轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)室,光照強度以室內(nèi)散射光為準,培養(yǎng)溫度調(diào)至22 ℃。培養(yǎng)18 d左右,子實體原基開始出現(xiàn),50~55 d左右,子實體成熟并開始彈射子囊孢子。
1.4ψ幽益咦擁ユ叻擲
取蛹蟲草成熟子座,倒置固定于不相接觸的PDA培養(yǎng)基上方,使子囊孢子可以彈射到培養(yǎng)基平板上。22 ℃恒溫培養(yǎng)2~3 d后,分別挑取子囊單孢菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面上,22 ℃恒溫培養(yǎng),待菌絲長滿斜面后保存?zhèn)溆谩?
1.5ψ幽業(yè)ユ叻擲刖株的配對及子實體誘導(dǎo)
將分離得到的單孢菌絲轉(zhuǎn)接于PDB液體培養(yǎng)基中25 ℃振蕩培養(yǎng)3~5 d,將所得液體單孢菌種單獨接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實體,即為單孢培養(yǎng)產(chǎn)子實體試驗;將所得液體單孢菌種兩兩配對混合后接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實體,即為配對培養(yǎng)產(chǎn)子實體試驗。每個培養(yǎng)樣品10個重復(fù),子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)方法如1.3中所述。
1.6ν核體和異核體的鑒定
從單孢菌株的培養(yǎng)和配對結(jié)果看,單孢分離菌株與親本菌株菌絲生長無明顯差異,菌株之間也沒有明顯形態(tài)方面的差異,結(jié)合子實體誘導(dǎo)試驗結(jié)果,本實驗將菌株是否能形成子實體作為區(qū)分同核體和異核體的標準,即正常條件下不能形成子實體的單孢分離株為單核的單孢分離株,而產(chǎn)生子實體的則不是。以此標準,單核體交配后產(chǎn)生子實體的是親和性交配,不產(chǎn)生子實體的則為不親和性交配。
2 結(jié)果與分析
2.1ψ幽益咦擁ユ叻擲虢峁
通過對C.m.H-07ZY1菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到9個子囊孢子單孢菌株。對這些菌株進行誘導(dǎo)子實體驗證培養(yǎng),結(jié)果其中8個不能產(chǎn)子實體,1個能產(chǎn)子實體,且子實體形態(tài)正常,子囊殼豐富。對C.m.H-04G13s9菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到11個子囊孢子單孢菌株,進行子實體誘導(dǎo)培養(yǎng),結(jié)果10個菌株不能產(chǎn)子實體,1個菌株能產(chǎn)子實體,且子實體形態(tài)正常,子囊殼豐富。
在實驗中鏡檢彈射的子囊孢子時,有時能觀察到2個或多個子囊孢子扭結(jié)在一起未能經(jīng)彈射分離成單孢的情況(見圖1),由此,筆者認為以上能產(chǎn)子實體的分離菌株不是子囊孢子的單孢菌株,而是分離中誤取的2個或多個子囊孢子扭結(jié)的混合菌株。這種情況若不加以區(qū)別,將對交配結(jié)果帶來極大誤差,也說明得到確鑿可靠的子囊孢子單孢是子囊菌中交配型研究的一個很重要前提。由于許多子囊菌的異核菌絲(在擔(dān)子菌中也稱為次級菌絲,即有性孢子經(jīng)過有效配對融合后形成的菌絲)在子囊菌生活史中能夠存活很長時間,若不能取得純子囊孢子單孢菌株,就可能把已經(jīng)異宗配合后的異核菌絲誤認為子囊孢子單孢菌株,給交配型研究結(jié)果帶來極大誤差。為避免上述誤差,本實驗只采用經(jīng)過驗證不能產(chǎn)子實體的菌株作為下一步單孢配對試驗的菌株。
2.2ψ幽益咦擁ユ呔株配對培養(yǎng)結(jié)果
將從C.m.H-07ZY1分離得到的8個單核體菌株兩兩配對培養(yǎng)誘導(dǎo)子實體,結(jié)果見表1。按交配的結(jié)果可將這些單核體分為兩組,組內(nèi)菌株間不親和,而組間親和,表1中分別用A和a標記其交配因子類型,這樣清楚反應(yīng)出蛹蟲草具有二極性異宗配合習(xí)性,不同交配型菌株在發(fā)生親和性反應(yīng)形成雙核體菌絲后具有良好的可育性,產(chǎn)生子實體并形成豐富的子囊殼。
子囊菌;A蛹蟲草;A交配型;A異宗配合
蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link]又名北冬蟲夏草,分類學(xué)上屬真菌門(Eumycota),子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes),球殼目(Sphaeriales),麥角菌科(Clavicepitaceae),蟲草屬(Cordyceps)[1]。蟲草屬真菌是一類具有重要藥用和開發(fā)價值的真菌,其中冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.]為我國傳統(tǒng)名貴滋補中藥材,由于野生資源稀少,價格極其昂貴,許多科研單位對其子實體人工培養(yǎng)進行了大量的研究工作,但至今尚未能規(guī)模培養(yǎng)[2~7]。蛹蟲草作為蟲草屬真菌的模式種,具有與冬蟲夏草相似的藥理功效,且人工規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成功,正逐漸成為冬蟲夏草的重要替代品,具有廣闊的市場前景。目前有關(guān)蛹蟲草的研究,主要集中于培養(yǎng)條件選擇、有效成分分析和藥理作用研究上[8~20],對其基本生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究仍較薄弱[21~24],對其交配型的研究幾為空白[25]。
真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式,即該真菌不需要兩個不同來源的菌絲交配,只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級菌絲就可獨立完成有性生活史。同宗配合分成初級同宗配合(primary homothallism)和次級同宗配合(secondary homothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式,即由同一有性孢子萌發(fā)形成的初級菌絲不能獨立完成有性生活史,只有通過兩個不同交配型的有性孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配,才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型的不親和性因子是一對還是兩對,也可分為兩類:具有一對不親和性因子的二極性異宗配合(bipolar heterothallism)和具有兩對不親和性因子的四極性異宗配合(tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言,二極性異宗配合菌的可親和率為50%,而四極性異宗配合菌的可親和率為25%,這是判斷是否二極性或四極性異宗配合的基本依據(jù)。在已研究的擔(dān)子菌中,約有90%的種屬于異宗配合真菌,其中,約有25%為二極性異宗配合真菌,75%為四極性異宗配合真菌[26,27]。而對子囊菌,現(xiàn)有報道種類中同宗配合占較大比例[27],但研究較多的粗糙脈孢菌(Neurospora crrassa)則為典型的二極性異宗配合真菌(A, a)[28] ;由于缺少像擔(dān)子菌中的鎖狀聯(lián)合一樣的簡易判斷標準,子囊菌關(guān)于交配型的研究比較困難而且報道較少。本文利用能在人工條件下完成全部生活史、并能較容易地分離到子囊孢子單孢的蛹蟲草菌種,率先進行了其交配特性的研究,旨在豐富對子囊菌的交配特性的認識,為蟲草屬內(nèi)不同真菌的交配特性研究提供參考。
1 材料與方法
1.1κ匝椴牧
實驗所用的2個蛹蟲草菌株C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9均采自長白山區(qū),為本實驗室在大量分離純化和篩選基礎(chǔ)上獲得的能成功培養(yǎng)出正常子實體的菌株。
1.2ε嘌基
PDA培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL,用于菌種分離和保存;
PDB培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,水1000 mL,用菌種液體培養(yǎng);
米飯培養(yǎng)基:25 g大米加35 g水,高壓滅菌后作為子實體培養(yǎng)基。
高新華:蛹蟲草(Cordyceps militaris)的交配型研究
1.3ψ郵堤迦斯づ嘌方法
將在PDA斜面活化的蛹蟲草菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中(75 mL/250 mL),轉(zhuǎn)速150 rpm、25 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d,再將所得的液體菌種稀釋(約100倍)轉(zhuǎn)接于瓶裝米飯培養(yǎng)基上(4 mL/瓶),瓶蓋中墊上濾紙,以避免空氣交換可能引發(fā)的污染,于25 ℃暗培養(yǎng)3~4 d,當(dāng)觀察到菌絲已明顯在培養(yǎng)基表面開始蔓延時,轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)室,光照強度以室內(nèi)散射光為準,培養(yǎng)溫度調(diào)至22 ℃。培養(yǎng)18 d左右,子實體原基開始出現(xiàn),50~55 d左右,子實體成熟并開始彈射子囊孢子。
1.4ψ幽益咦擁ユ叻擲
取蛹蟲草成熟子座,倒置固定于不相接觸的PDA培養(yǎng)基上方,使子囊孢子可以彈射到培養(yǎng)基平板上。22 ℃恒溫培養(yǎng)2~3 d后,分別挑取子囊單孢菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面上,22 ℃恒溫培養(yǎng),待菌絲長滿斜面后保存?zhèn)溆谩?
1.5ψ幽業(yè)ユ叻擲刖株的配對及子實體誘導(dǎo)
將分離得到的單孢菌絲轉(zhuǎn)接于PDB液體培養(yǎng)基中25 ℃振蕩培養(yǎng)3~5 d,將所得液體單孢菌種單獨接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實體,即為單孢培養(yǎng)產(chǎn)子實體試驗;將所得液體單孢菌種兩兩配對混合后接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實體,即為配對培養(yǎng)產(chǎn)子實體試驗。每個培養(yǎng)樣品10個重復(fù),子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)方法如1.3中所述。
1.6ν核體和異核體的鑒定
從單孢菌株的培養(yǎng)和配對結(jié)果看,單孢分離菌株與親本菌株菌絲生長無明顯差異,菌株之間也沒有明顯形態(tài)方面的差異,結(jié)合子實體誘導(dǎo)試驗結(jié)果,本實驗將菌株是否能形成子實體作為區(qū)分同核體和異核體的標準,即正常條件下不能形成子實體的單孢分離株為單核的單孢分離株,而產(chǎn)生子實體的則不是。以此標準,單核體交配后產(chǎn)生子實體的是親和性交配,不產(chǎn)生子實體的則為不親和性交配。
2 結(jié)果與分析
2.1ψ幽益咦擁ユ叻擲虢峁
通過對C.m.H-07ZY1菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到9個子囊孢子單孢菌株。對這些菌株進行誘導(dǎo)子實體驗證培養(yǎng),結(jié)果其中8個不能產(chǎn)子實體,1個能產(chǎn)子實體,且子實體形態(tài)正常,子囊殼豐富。對C.m.H-04G13s9菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到11個子囊孢子單孢菌株,進行子實體誘導(dǎo)培養(yǎng),結(jié)果10個菌株不能產(chǎn)子實體,1個菌株能產(chǎn)子實體,且子實體形態(tài)正常,子囊殼豐富。
在實驗中鏡檢彈射的子囊孢子時,有時能觀察到2個或多個子囊孢子扭結(jié)在一起未能經(jīng)彈射分離成單孢的情況(見圖1),由此,筆者認為以上能產(chǎn)子實體的分離菌株不是子囊孢子的單孢菌株,而是分離中誤取的2個或多個子囊孢子扭結(jié)的混合菌株。這種情況若不加以區(qū)別,將對交配結(jié)果帶來極大誤差,也說明得到確鑿可靠的子囊孢子單孢是子囊菌中交配型研究的一個很重要前提。由于許多子囊菌的異核菌絲(在擔(dān)子菌中也稱為次級菌絲,即有性孢子經(jīng)過有效配對融合后形成的菌絲)在子囊菌生活史中能夠存活很長時間,若不能取得純子囊孢子單孢菌株,就可能把已經(jīng)異宗配合后的異核菌絲誤認為子囊孢子單孢菌株,給交配型研究結(jié)果帶來極大誤差。為避免上述誤差,本實驗只采用經(jīng)過驗證不能產(chǎn)子實體的菌株作為下一步單孢配對試驗的菌株。
2.2ψ幽益咦擁ユ呔株配對培養(yǎng)結(jié)果
將從C.m.H-07ZY1分離得到的8個單核體菌株兩兩配對培養(yǎng)誘導(dǎo)子實體,結(jié)果見表1。按交配的結(jié)果可將這些單核體分為兩組,組內(nèi)菌株間不親和,而組間親和,表1中分別用A和a標記其交配因子類型,這樣清楚反應(yīng)出蛹蟲草具有二極性異宗配合習(xí)性,不同交配型菌株在發(fā)生親和性反應(yīng)形成雙核體菌絲后具有良好的可育性,產(chǎn)生子實體并形成豐富的子囊殼。
