一、雙孢蘑菇的有性生殖

（一）雙孢蘑菇的繁殖方式

　　雙孢蘑菇的繁殖方式有無性繁殖和有性生殖兩種。其無性繁殖是指由母細胞直接產(chǎn)生子代的繁殖方式。Hayes(1978) 描述了雙孢蘑菇的無性生殖能產(chǎn)生厚垣孢子和次生孢子，但它們在雙孢蘑菇的生活史研究中少有提及。雙孢蘑菇有性生殖是其生活史的主要部分。它通過兩性核在擔(dān)子中的結(jié)合，或兩性細胞以菌絲融合方式結(jié)合后形成新的個體。

（二）雙孢蘑菇的有性生殖

　　雙孢蘑菇的有性生殖比較特殊，而且比較復(fù)雜，但也是從擔(dān)孢子萌發(fā)開始，經(jīng)過菌絲體和子實體兩個發(fā)育階段，直到新一代擔(dān)孢子產(chǎn)生、成熟而結(jié)束。雙孢蘑菇的有性生殖有兩個分支：一支是含“＋”“－”兩個不同交配型細胞核的擔(dān)孢子，不需要交配就可以完成生活史，另一支是僅含有“＋”核的擔(dān)孢子和僅含“－”核的擔(dān)孢子，萌發(fā)成菌絲后，需經(jīng)交配才能完成生活史。在典型的雙孢蘑菇中，雙孢擔(dān)子占絕大多數(shù)，四孢擔(dān)子為數(shù)較少，所以次級同宗配合的遺傳方式在其完整的有性生殖生活史中占有很大的比例。也就是說，通常，雙孢蘑菇的擔(dān)子上僅產(chǎn)生兩個擔(dān)孢子，絕大多數(shù)擔(dān)孢子內(nèi)含有“＋”“－”兩個核，即擔(dān)孢子通常只獲得４個減數(shù)分裂產(chǎn)物中的２個。這種異核擔(dān)孢子萌發(fā)出的菌絲是異核的菌絲體，它們不產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合，不需要經(jīng)過交配就能完成其生活史，因此這種異核擔(dān)孢子是自體可育的。1972年Raper等就詳細地闡述了雙孢蘑菇特殊的二極性次級同宗配合的生活史。 此外，雙孢蘑菇的擔(dān)子偶爾也能產(chǎn)生單個、三個、四個甚至八個擔(dān)孢子。據(jù)統(tǒng)計，一孢擔(dān)子占3%，二孢擔(dān)子占81.8%，三孢擔(dān)子占12.8%，四孢擔(dān)子占1.2%，五孢擔(dān)子占0.013%，七孢擔(dān)子占0.003%。單核孢子或同核的雙核孢子是以異宗配合的遺傳方式來完成其生活史的。因此，雙孢蘑菇的有性生殖生活史可以用圖3-1來表示。

圖3-1 雙孢蘑菇有性生殖生活史(參考《自修食用菌學(xué)》,1987)

1.同核擔(dān)孢子的萌發(fā) 2.同核菌絲體 3.同核菌絲體之間的質(zhì)配

4.異核擔(dān)孢子的萌發(fā) 5.異核菌絲體 6.子實體

7.擔(dān)子 8.接合的細胞核 9.第一次減數(shù)分裂

10.第二次減數(shù)分裂 11.異核擔(dān)孢子的形成 12.擔(dān)孢子的彈射

13.同核擔(dān)孢子的形成 14.三孢擔(dān)子 15.四孢擔(dān)子

16.單核擔(dān)孢子 17.單核擔(dān)孢子的萌發(fā)

1992年，在美國加州發(fā)現(xiàn)了四孢變種。這不但豐富了種質(zhì)資源，也極大地推動了性因子的研究，同時也使得雙孢蘑菇有性生殖生活史的研究得到進一步完善。四孢變種的生活史是以異宗配合為主要生殖方式。雜交研究表明，四孢擔(dān)子性狀相對雙孢擔(dān)子是顯性的，三孢擔(dān)子介于二者之間。下圖為1995年P(guān)hillippe 示意的雙孢蘑菇有性生殖生活史(圖3-2)。

圖3-2 雙孢蘑菇有性生殖生活史(Phillippe,1995)

二、雙孢蘑菇的性特征

　　雙孢蘑菇缺乏一般擔(dān)子菌常有的二個特性。第一，它的擔(dān)子上通常只形成２個擔(dān)孢子而不是４個；第二，它的營養(yǎng)菌絲不形成鎖狀聯(lián)合。雙孢蘑菇是同宗配合還是異宗配合的？它的結(jié)實性是由性因子控制的嗎？它的雙孢擔(dān)子的意義又何在呢？

　　雖然雙孢蘑菇已有３００多年的栽培歷史。但是對其有性生殖和遺傳基礎(chǔ)的研究和了解卻僅僅開始于本世紀(jì)。遺傳標(biāo)記的更新是研究發(fā)展和深化的主要線索。從外觀形態(tài)表型標(biāo)記，如菌落形態(tài)、子實體特性到生理生化標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型及抗藥、抗病性標(biāo)記，再到分子水平的同工酶、RFLP、RAPD標(biāo)記，不斷加強著人們對雙孢蘑菇的遺傳、生理、生態(tài)行為的觀察、分析及判定能力，推動著雙孢蘑菇遺傳研究的發(fā)展。然而，取得卓有成效的研究結(jié)果，卻是近幾十年的事。

（一）雙孢蘑菇是次級同宗配合的物種

　　1929年，Lambert發(fā)表的論文在國際上首次探討了雙孢蘑菇的性， 他成功地分離出９個單孢子培養(yǎng)物，結(jié)果表明它們都具有產(chǎn)生正常子實體的能力。這是人們首次懂得可以用蘑菇孢子萌發(fā)成的菌絲體來制備生產(chǎn)用種。Sinden(1937)也用單孢子菌株做了試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，事實上有大約三分之一的單孢子菌株根本就不結(jié)菇。這個試驗首次暗示了蘑菇生殖系統(tǒng)的復(fù)雜性。它的子實體既產(chǎn)生自體可育的擔(dān)孢子，也產(chǎn)生自體不育的擔(dān)孢子。

　　1943年，Kligman又對蘑菇生殖系統(tǒng)做了進一步的研究， 他證實了蘑菇能產(chǎn)生自體可育和自體不育的兩種分離物，并用１１個自體不育的單孢分離物做雜交試驗，共做了５５個配對組合，結(jié)果有７個組合恢復(fù)了可育性。Kligman還用5個分離自棕色菌株的自體不育株和3個分離自白色菌株的自體不育株配對雜交，結(jié)果15 個配對組合中有3個產(chǎn)生了子實體。 盡管他的試驗結(jié)果提示了蘑菇可能存在一個不親和性因子或不親和性系統(tǒng)，但是Kligman的結(jié)論卻是蘑菇是無性的， 他認為蘑菇核的融合在孢子產(chǎn)生之前，是“沒有遺傳學(xué)意義的殘余特性”。Lambert(1960) 回顧了雙孢蘑菇的遺傳與育種，認為只有具不同核的孢子才能形成可育的單孢培養(yǎng)物。他提出一個遺傳研究的途徑，即從單個擔(dān)子上分離出一對孢子，從單孢培養(yǎng)物中分離出同核的部分。Pelham(1967)首次從菌褶上直接分離出擔(dān)孢子，并檢驗了從雙孢和三孢擔(dān)子上分離的孢子的結(jié)菇能力。 這項工作成為美國的 Miller( 1971) 和英國的Elliott(1972)進行蘑菇生殖系統(tǒng)分析的起點。Miller和Elliott都從四孢擔(dān)子上分離出孢子。Miller(1971)研究了12個此類培養(yǎng)物，結(jié)果全部都是不育的。用這12個培養(yǎng)物配對培養(yǎng)，66個配對組合中有34個結(jié)菇。Elliott(1972) 分析了一套完整的四分體，結(jié)果表明，6個可配對的組合中有4個結(jié)菇。這些研究提供的證據(jù)表明，雙孢蘑菇中有一個交配系統(tǒng)在起作用。雙孢蘑菇的性特征介于同宗配合與異宗配合之間，屬于次級同宗配合類型。

（二）雙孢蘑菇的交配親和性受二極性或單因子控制，它的結(jié)實性依賴于性因子的配合。

　　雙孢蘑菇性因子的遺傳研究主要在兩方面展開，一是性因子的極性研究，二是性因子等位基因的尋找與定位。

　　1972年，Miller和Kananen做了較全面的交配試驗，結(jié)果表明， 交配親和性受單一因子控制。Ginns(1974)重復(fù)解釋了Miller(1971)的配對數(shù)據(jù)， 認為親和性更可能是受雙因子控制。 但是， 證據(jù)表明是單一因子系統(tǒng)在起作用。 Miller 和Kananen(1972) 所做的進一步分析和另外三種蘑菇已被清楚地闡明是由單因子控制結(jié)實性的事實(Elliott，1978;Raper，C.A.，1976b)都支持雙孢蘑菇受單因子控制的觀點。

　　進一步的研究還表明，雙孢蘑菇的性因子存在著復(fù)等位基因(Raper等， 1972;Elliott，1979;Castle等，1988;Wang等，1990)。Elliott 用分離自一個棕色菌株的沒有特定標(biāo)記的分離物與交配型A1與A2培養(yǎng)物間雜交，結(jié)果全部可育。Castle用RFLP為標(biāo)記跟蹤商業(yè)菌株與野生菌株同核體間的雜交時發(fā)現(xiàn)，其中三個同核體兩兩配對均可雜交成功。Wang等以同工酶為標(biāo)記進行高產(chǎn)菌株與優(yōu)質(zhì)菌株的同核體間雜交時也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。 1992 年， 美國加州發(fā)現(xiàn)了雙孢蘑菇的四孢變種。Micheeline，Lmbernoow 等用四孢變種與傳統(tǒng)的雙孢蘑菇菌株雜交也發(fā)現(xiàn)了性因子等位基因。至此，人們共發(fā)現(xiàn)了14個雙孢蘑菇性因子等位基因，而且這些等位基因出現(xiàn)的概率均一(Imbernon等，1995)。

　　那么，雙孢蘑菇的性因子與結(jié)實性的關(guān)系又如何呢? May等(1982)，王澤生等(1990)用經(jīng)同工酶鑒定為雜種F1的培養(yǎng)物做栽培試驗，發(fā)現(xiàn)此類培養(yǎng)物并非全部恢復(fù)可育性，即部分沒有結(jié)菇。這個結(jié)果暗示，決定蘑菇細胞壁親和性的性因子并不保證決定子實體的發(fā)生。Xu等(1993)用RFLP和RAPD標(biāo)記技術(shù)研究的結(jié)果也認為蘑菇子實體的形成有賴于性因子，但由性可親和的同核菌絲配合形成的異核體并不絕對保證子實體的形成。

　　1993年，多倫多大學(xué)生物系的Xu等對性因子開展了染色體與DNA水平上的探討，以RFLP和RAPD標(biāo)記技術(shù)成功地將性因子定位在雙孢蘑菇最大的連鎖群，即染色體 I上。目前距性因子位點最近的遺傳標(biāo)記有35個遺傳圖距(約600Kb)， 用染色體步查法來分離性因子仍存在技術(shù)上的困難。

（三）雙孢擔(dān)子核減數(shù)分裂行為的研究

　　雖然，雙孢蘑菇有大約80%以上的擔(dān)子通常是雙孢的，而且， 每個孢子通常具有２個不同交配型的核，因此是自體可育的，具有結(jié)菇能力。但是，在蘑菇菌褶上還可觀察到３孢、４孢擔(dān)子等等，這些異常擔(dān)子上的孢子大多數(shù)情況下只得到單個核，因此無結(jié)菇能力。就是雙孢擔(dān)子上的部分孢子也是自體不育的，這些孢子雖然具有雙核，但２個核具有相同的交配型。

　　為什么大多數(shù)雙孢擔(dān)子的擔(dān)孢子具有異核性？為什么有的雙核孢子中的核具親和性，而有的又不親和呢？雙孢擔(dān)子中核減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個核是如何配對遷移入兩個孢子的呢？

　　幾十年來，對于雙孢蘑菇遺傳方式的研究，始終圍饒著擔(dān)子內(nèi)減數(shù)分裂行為這一主題，其核心問題就是減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個核在兩個孢子中是如何分配的。顯微操作使直接從擔(dān)子上分離單孢子成為可能后，研究者已注意到雙孢蘑菇的孢子多數(shù)是自體可育的。Sarazin于1955年提出在雙孢蘑菇擔(dān)子中，減數(shù)分裂后， 具不同性的兩個核是非隨機地遷移入每一個擔(dān)孢子的。1959年，Evans 研究了擔(dān)子中的減數(shù)分裂，并細心地觀察了減數(shù)分裂過程紡綞絲的動態(tài)變化，提出較完整的核的非隨機分離理論。他估計，在減數(shù)分裂的第一次分裂分離中產(chǎn)生異核體的機率為80%， 在第二次分裂分離中產(chǎn)生異核體的機率為60%(圖3-3)。1982年，Royse和May應(yīng)用同工

圖3-3 雙孢蘑菇減數(shù)分裂過程紡綞絲排列類型與異核體產(chǎn)生頻率(Evans,1959)

        酶技術(shù)研究雙孢蘑菇的遺傳，發(fā)現(xiàn)約90% 的單孢子在多個同工酶位點上是異質(zhì)的，而同核孢子數(shù)不到百分之五，認為減數(shù)分裂后非姐妹核有進入同一孢子的非隨機傾向。隨后，Castle等人(1987，1988)以RFLPs為遺傳標(biāo)記分析雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)及大肥菇(Agaricus bitorqus)的種間及種內(nèi)多態(tài)性，Summerbell(1989)用核DNA 的單拷貝探針跟蹤分析了由異核親本產(chǎn)生的單孢子的遺傳物質(zhì)存在情況，Kliush(1992)應(yīng)用RAPD進行遺傳親子分析。這些研究均支持上述觀點，即雙孢蘑菇減數(shù)分裂后形成的四個單倍體核有非姐妹核進入同一孢子的非隨機遷移傾向。核非隨機遷移行為導(dǎo)致絕大多數(shù)孢子為異核的現(xiàn)象，被解釋為是由于該物種為防止同核體隱性純合可能導(dǎo)致的菌株致殘、致死效應(yīng)，而進化出的適應(yīng)性遺傳機制，該機制最大程度地保持了親本的異核性質(zhì)。同核菌株在RFLP及RAPD分析研究中均表現(xiàn)為一些電泳譜帶明顯缺失，這一點與王澤生等人(1989)應(yīng)用同工酶鑒定同核子的研究結(jié)果一致。電泳譜帶的缺失可能反映了同核體缺乏執(zhí)行正常生命功能的基因。因此必須注意到，由此導(dǎo)致的不易萌發(fā)、生存能力低下的同核體在實驗觀察中就可能被遺漏，造成觀察中的同核孢子比率偏離真實比率。

　　事實上，絕大多數(shù)孢子異核的現(xiàn)象，基本上都是以孢子萌發(fā)成的菌絲體為試驗材料進行研究的。假如是由于同核體不易萌發(fā)，或生存能力低下造成觀察中同核孢子比率偏低的話，那么，減數(shù)分裂后核是隨機配對遷移進入孢子的理論就值得重視。1980年Langton和Elliott以營養(yǎng)缺陷型為標(biāo)記進行研究，提出核的分配過程是隨機的觀點，他們著文詳細闡述了雙孢蘑菇減數(shù)分裂后的四個核在兩個孢子中隨機分配的模型。按此預(yù)測，一個孢子接受異核的概率將是接受同核概率的兩倍(圖3-4) ，這和許多檢驗?zāi)⒐絾捂叻蛛x物可育性研究者的發(fā)現(xiàn)相一致(Sinden，1937;Kligman，1943;Elliott，1972)。Langton認為這是異核孢子占大多數(shù)的原因。

圖3-4 雙孢蘑菇減數(shù)分裂產(chǎn)物隨機配對模型(Elliott等,1980)

    　隨機遷移假設(shè)的重要性是它預(yù)期了基因的分離并可用以繪制基因在染色體上的位置，但在雙孢蘑菇中不易檢測。Elliott和Challen(1983a) 檢測了次級同宗配合的雙孢墨汁鬼傘營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記分離的預(yù)期比例，所獲得的數(shù)據(jù)和原養(yǎng)型對營缺型分離株的5:1的預(yù)期比例完全吻合。1991年， 王澤生等以酯酶同工酶為遺傳標(biāo)記研究標(biāo)記位點EstA，B和C在雜交子二代中的分離與重組行為時，發(fā)現(xiàn)等位基因的分離比均為1:4:1。這個結(jié)果支持如下觀點:擔(dān)子中減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個核隨機配對遷移入兩個擔(dān)孢子是雙孢蘑菇種的特怔。

圖3-5 雙孢蘑菇減數(shù)分裂核隨機配對遷移結(jié)果出現(xiàn)異常擔(dān)子的典型機率( Elliott,1983)

圖3-5 顯示了雙孢蘑菇生活史中核隨機配對遷移的結(jié)果和出現(xiàn)異常擔(dān)子的典型機率。從另一角度看問題，雙孢蘑菇也可能屬于單因子控制的異宗配合的種，但是這種異宗結(jié)合被擔(dān)子的雙孢特性所掩蓋。1992年，在美國加州發(fā)現(xiàn)了雙孢蘑菇的四孢變種。在這一變種中，四孢擔(dān)子占絕大多數(shù)，異宗配合是其主要的有性生殖方式。