雷德柱1 于淑娟2

（1 廣州大學生物與化學工程學院，廣州 510405；*2 華南理工大學食品與生物工程學院， 廣州 510640）

おフ婢深層發(fā)酵過程中，菌絲球的形態(tài)對其生產(chǎn)能力具有顯著的影響。最近，國外文獻報道了菌絲球形態(tài)特征的自動成像分析，菌絲球形態(tài)對其生產(chǎn)能力的影響［1～5］和不 同水平上各種因素影響菌絲球形態(tài)及其生產(chǎn)能力的相應數(shù)學模型［1，3～5］。國內(nèi)在這方面的研究很少，且關于菌絲球形態(tài)結構與發(fā)酵過程的研究常常是分開進行的。筆 者對發(fā)酵過程中灰樹花菌絲球的形態(tài)結構及其與發(fā)酵過程的關系進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 灰樹花(Grifola frondosa)Ь株GIM5.64，購自廣東省 微生物研究所。

1.1.2 試劑 乙醇、冰醋酸、福爾馬林和二甲苯均為分析純，廣州化學試 劑廠產(chǎn)品；切片專用石蠟，上海三精工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要設備 電熱恒溫箱， 廣州醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AO82型石蠟切 片機，美國LKB公司產(chǎn)品； Leica MPS 30光學顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 參閱文獻［6］。

1.2.2 石蠟切片與光學顯微鏡觀察 分別取深層培養(yǎng)1～8d的灰樹花菌絲 球，F(xiàn)AA固定液固定，石蠟切片，切片厚8～10μm，番紅補搪倘舊，光學顯微鏡下觀察菌絲球的內(nèi)部結構［7］。

1.2.3 菌絲球和菌絲球核直徑的測量 隨機取30個帶有營養(yǎng)液的菌絲球， 排成直線，測量各菌絲球的直徑，取其平均值；隨機取與上述菌絲球培養(yǎng)時間相同的30個菌絲球，經(jīng)石蠟切片后測量菌絲球核直徑，取其平均值。

2 結果

2.1 遲滯期菌絲球的形態(tài)

セ沂骰ㄉ畈惴⒔退用種子為對數(shù)生長后期的菌絲球，這種菌絲球的直徑較小，約2mm，菌 絲球周圍的菌絲較長，占菌絲球直徑的2/3以上。圓形的、發(fā)育比較充分的菌絲球，其中央 有一個明顯的核，核內(nèi)菌絲染色較深，說明菌絲的生活力較強（圖1）。有的菌絲球形狀不規(guī)則，核并不象前者那么明顯。

2.2 對數(shù)生長期菌絲球的形態(tài)

ヅ嘌48h后形成的新菌絲球如圖2所示。這些菌絲球形狀不規(guī)則，菌絲排列相對松散、舒展。它們是菌絲球經(jīng)過遲滯期后進入快速生長期的標志。

WX(20。2JZ(圖1 培養(yǎng)過程中菌絲球和核的平均直徑 Fig. 1 Mean diameters of the mycelial pellets andtheir nuclei during the subm erged cultureJZ(圖2 發(fā)酵過程中核直徑占菌絲球直徑的百分比Fig. 2 The ratio of the nucleus diameter to themycelial pellet diameter during the submerged cultureWX)

Cox PW等研究黑曲霉(Aspergillus niger) ATCC11414的深層發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，由遲滯期轉(zhuǎn)入快速生長期時，菌絲球及其核的形狀具有高度不均一性，在隨后的發(fā)酵過程中，又變 得較為均勻［2］。筆者對灰樹花深層發(fā)酵菌絲球形態(tài)進行研究時發(fā)現(xiàn)，對數(shù)生長期，菌絲球及其核的形狀不均勻，質(zhì)地也不均勻。菌絲球核可以分為兩部分，位于核中心、著 色稍淺的部分為內(nèi)核部分，著色較深的為外核部分。這說明種子菌絲球轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，菌絲球核外部分的菌絲首先獲得較優(yōu)越的生長條件，生長較快，形成的新菌絲著色較 深，菌絲球內(nèi)核部分的菌絲雖然也開始生長，但明顯比核外部分的菌絲慢了一步。

ヅ嘌60h后，菌絲球的核及其周圍菌絲的情況如圖3所示。這時，核內(nèi)菌絲的著色較深，且較均勻，內(nèi)核部分和外核部分的界限開始消失。這說明底物及溶氧已經(jīng)充分擴散到核內(nèi)部， 核內(nèi)菌絲的生長比較一致，內(nèi)核部分不再受營養(yǎng)成分及溶氧的限制，這與Cox PW等人的觀察結果比較相符［2］。

ヅ嘌72h和84h后，核周圍部分的菌絲生長旺盛，菌絲長度和密度都增加，著色仍然較深( 圖4)。但是，與前一階段不同的是，核在菌絲球中所占的體積比明顯下降，菌絲球表面的菌 絲生長速度很快。

ヅ嘌96h后，菌絲球的顯著特點就是菌絲球周圍菌絲的長度相對變短，核在菌絲球中所占體積比增大，核內(nèi)重新出現(xiàn)著色不均勻的現(xiàn)象(圖5)。這說明菌絲球直徑和核的直徑增大后 ，底物及溶氧的傳遞又受到限制，導致內(nèi)核部分的菌絲生長速度放慢。這并不完全是因為菌絲的生長速度減慢，部分原因可能是因為菌絲的彈性降低，變得易于斷裂。搖瓶或攪拌所產(chǎn) 生的剪切力使得菌絲從菌絲球表面脫落，導致菌絲變短，核在菌絲球中所占體積比增大。這時，在發(fā)酵液中可以看到較多的松散菌絲，從而間接證明了上述觀點。

Cui YQ等認為，菌絲球損傷包括破碎和刮切（即較老化的菌絲自身彈性下降，在攪拌的機械力作用下容易發(fā)生斷裂，由于菌絲球為圓形，故形象地謂之“刮切”）兩種情況。破碎后 的菌絲球碎片重新生長為小菌絲球，而刮切作用形成具有較短菌毛的菌絲球和散落的松散菌 絲［5］。

Nielsen J(1995)認為，在攪拌容器中菌絲球的破碎與能量輸入呈線性相關，甚至在能量輸入較低的情況下仍然有明顯的破碎現(xiàn)象發(fā)生［1］?；覙浠ㄉ顚影l(fā)酵的實際情況并 非完全如此，因為菌絲球的破損碎片在發(fā)酵液中并不常見，但是可以觀察到菌絲球上菌毛長短的變化和松散的菌絲。也就是說，在搖瓶培養(yǎng)中刮切機制占主導地位。經(jīng)過刮切的菌絲球 繼續(xù)生長，而松散菌絲或經(jīng)過纏繞形成菌絲球，或以松散菌絲形式生長。菌絲老化后，生長速度跟不上刮切速度時，菌絲球直徑不再增加。

2.3 平衡期菌絲球的形態(tài)

ヅ嘌120h后，菌絲球中央的核所占的體積比進一步加大，內(nèi)核部分菌絲著色變淺，外核部分的菌絲著色深淺不一(圖6)。這時，不僅內(nèi)核部分的菌絲受到底物及溶氧限制，外核部分 的營養(yǎng)和氧氣供應也開始跟不上菌絲生長的需要，這或許是因為發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物開始積累，發(fā)酵液的pH值發(fā)生較大變化，從而抑制了菌絲的生長。這一階段菌絲的生長速度放慢，主 要特點是代謝產(chǎn)物的積累。

ヅ嘌144h后，菌絲球核內(nèi)外兩層結構之間的界限開始變得模糊。這說明菌絲球的生長已經(jīng)進入平衡中期（圖7）。這一時期，生物量趨于穩(wěn)定，胞外多糖產(chǎn)量達到高峰。根據(jù)Cui Y Q等人的菌絲球損傷機制模型，菌絲球分為三個區(qū)：外層菌毛區(qū)、中間活躍區(qū)和內(nèi)層饑餓區(qū)［4］。菌毛區(qū)向外生長；中間活躍區(qū)的深度取決于菌絲球密度、生長速率和發(fā)酵液 中的溶氧壓；而饑餓區(qū)中溶氧壓不足，菌絲自溶。從切片中觀察到上述三個區(qū)中的中間活躍區(qū)和饑餓區(qū)合而為一，說明此時溶氧壓的限制使中間活躍區(qū)的活動減弱，但還不至于使饑餓 區(qū)的菌絲產(chǎn)生自溶。

ヅ嘌156h和168h后的菌絲球，不僅內(nèi)核部分和外核部分的界限消失，整個核著色很淺，菌毛區(qū)的菌絲很短（圖8）。這說明菌絲球外表的菌絲大部分已經(jīng)脫落，這是菌絲生長進入平 衡后期的形態(tài)標志。

2.4 衰老期菌絲球的形態(tài)

ヅ嘌172h后的菌絲球，其主要特點是表面菌絲幾乎全部脫落，菌絲球光滑；核開始解體，核中出現(xiàn)許多較大的空腔。這說明菌絲球已經(jīng)老化，菌絲部分自溶。

2.5 發(fā)酵過程中菌絲球直徑的變化

ピ謖個發(fā)酵過程中，菌絲球直徑的變化以及菌絲球核占菌絲球直徑百分比的變化情況如圖 9和圖10所示。

ゴ誘飭較鈧副昊本上能夠判斷出菌絲球生長的幾個時期：第1～2天，種子菌絲球直徑和 核直徑經(jīng)過刮切后下降，開始形成新的菌絲球，為遲滯期；第2～4天，菌絲球和核直徑逐漸 增大，為線性生長期，這一時期菌絲生長最快，生物量迅速增加；第5天菌絲球直徑趨于穩(wěn) 定， 核直徑繼續(xù)增加，菌絲由線性生長期向平衡期過度，這一時期生物量的增長速度減慢，而胞外 多糖產(chǎn)量迅速增加；第6天，菌絲生長進入平衡中期，這一時期，生物量趨于穩(wěn)定，胞外多糖產(chǎn)量達到高峰。由菌絲球切片可知，第7天和第8天，菌絲球已經(jīng)老化，開始自溶，生物量 趨于下降，菌絲生長進入衰老期。

3 討論

ビ泄匚南自報道了底物和溶氧壓限制與菌絲細胞生長和分化的關系，認為充足的底物及溶氧壓可促進菌絲細胞生長，而底物與溶氧壓的限制則誘導菌絲細胞分化，分化的菌絲細胞主要積累代謝產(chǎn)物［8，9］。因此，一般發(fā)酵過程中，早期要促進細胞生長，而線性生長期后則應控制其生長速度，促使細胞分化，從而積累代謝產(chǎn)物。本研究中，灰樹花菌絲 球在線性生長期后生長速度減慢，這有利于菌絲分化和胞外多糖的積累（圖11）。

Becker P(1995)［10］和Defren K(1993)［11］描述了隆紋黑蛋巢菌(Cya thus striatus)Ь絲球的生長模式：小的菌絲球形成生長區(qū)，得到充足的氧和營養(yǎng)供應， 隨著其體積的增大，傳遞到中心的氧受到限制，在氧限制區(qū)域誘導細胞分化并形成胞外多糖。由于菌絲球直徑超過一定大小后就會產(chǎn)生氧限制， 在無氧條件下會形成

ね11 培養(yǎng)過程多糖的積累Fig. 11 Accumul ation of polysaccharidesduring the submerged cutureWX) WT 乙醇，而較長時間的氧限制會導致菌絲球自溶。灰樹花在所有已經(jīng)研究過的食用菌中需氧量 最大［12］，發(fā)酵后期，培養(yǎng)基中溶解氧受到限制時，更容易發(fā)生自溶。

ヅ嘌基營養(yǎng)不足、pH降低、產(chǎn)物積累、流變學性質(zhì)和溶氧壓都會影響發(fā)酵環(huán)境，從而影響菌絲球的形態(tài)。營養(yǎng)物質(zhì)和氧擴散的限制導致菌絲生長僅限于近菌絲球表面的區(qū)域，2 氧饑餓導致直徑大的菌絲球中空核的形成［13，14］。菌絲球大小和形態(tài)的控制對防止菌絲球內(nèi)部的傳遞限制非常重要。維持產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)生長 發(fā)育的菌絲球直徑上限為400μm［15］。

Welssels JGH(1988)和BartnickiGarcias(1968)報道，1，3β財暇厶敲縛梢栽謁孔 真菌菌絲的頂端生長中參與細胞壁的形成，它可以催化1，3β財暇厶塹暮銑珊徒到庹舛 可逆反應［8，9］。Stahmann K等發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea) Э剎生4種1，3β財暇厶敲福GluⅠ、GluⅡ、GluⅢ、GluⅣ），生長在葡萄糖為唯一 碳源的培養(yǎng)基中時，培養(yǎng)基上清液中只出現(xiàn)GluⅢ。當培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡后，真菌的胞外多糖即被降解為碳源。在這一生長時期，其它三種酶也出現(xiàn)，而且所有四種酶的活性都增 加［16］。

ビ紗絲梢約偕瑁當發(fā)酵進入平衡后期，底物幾乎耗盡，菌絲開始自溶，生物量開始下降。這時菌絲細胞開始利用已經(jīng)合成的胞外多糖作為碳源來維持生命活動，從而導致胞外多糖產(chǎn) 量也開始下降。根據(jù)有關文獻的報道和筆者的研究結果，為了最大限度地獲得灰樹花胞外多糖，從形態(tài)上來看，應該在菌絲球開始自溶之前結束發(fā)酵；從菌絲積累胞外多糖來看， 2應該在多糖積累達到高峰，且已經(jīng)產(chǎn)生的胞外多糖還沒有被菌絲中的β財暇厶敲附到 成可被利用的單糖、從而導致菌絲的第二次生長之前結束發(fā)酵。把這兩者有機結合起來就能較好地控制發(fā)酵周期。

お 參 考 文 獻

ぃ1］ Nielsen J, Krabben P. Hyphal growth and fragmentation of Penicillium chrysogenum in submerged cultures［J］. Biotec hnol. and Bioeng.,1995,46:588～598.

ぃ2］ Cox PW，Thomas CR. Classification and measurement of fungal pellets by automated image analysis［J］. Biotechnol. and Bioeng., 1992, 39:94 5～952.

ぃ3］ Gehrig I, Bart HJ, Anke T，et al. Influence of morphology and rheology on the production characteristics of the Basidiomycete Cyathus s triatusВJ］. Biotechnol. and Bioeng., 1998,59(5): 525～533.

ぃ4］ Cui YQ, Okkerse WJ, van der Lans RGJM， et al. Modeling a nd measurements of fungal growth and morphology in submerged fermentations［J］. Biotechnol. and Bioeng.,1998,60(2): 217～229.

ぃ5］ Cui YQ, van der Lans RGJM, Luben KCAM. Effect of agitation intensities on fungal morphology of submerged fermentation［J］. Biotechnol. an d Bioeng.,1997,55(5): 715～725.

ぃ6］ 雷德柱.糖質(zhì)溶液中發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花胞外多糖的研究［J］.微生物學通報，2 001，28(3):59～19.

ぃ7］ 鄭國钅昌.生物顯微技術 ［M］.北京:人民教育出版社,1978.

ぃ8］ BartnickiGarcia S. Cell wall chemistry, morphogenesis and taxonomy of fungi［J］. Annu. Rev. Microbiol.， 1968,22:87～105.

ぃ9］ Wessels JGH. A steady state model for apical wall growth in fungi［J］. Acta Botanica Neerlandica，1988,37:3～16.

ぃ10］ Becker P. Verfahrenstechnische Untersuchungen zur Striatalsynthe se bei der Fermentation des Basidiomyceten Cyathus striatusВD］. Kaiserslau tern, Germany Universit]t Kaiserslautern, 1995.

ぃ11］ Defren K. Untersuchung der Auswirkungen von rührertyp und rühr ergriβe auf das Fermentation sverhalten des Pilzes Cyathus striatusВJ］.V DIFortschrittsbericht，1993, 91（17）.

ぃ12］ 黃年來.自修食用菌學［M］.南京:南京大學出版社，1988.

ぃ13］ Clarke DS. Submerged citric acid fermentation of ferrocyanide treated beet molasses: Morphology of pellets of Aspergillus nigerВJ］. Can. J.Microbiol.，1962, 8:133～136.

ぃ14］ Edelstein L, Hadar Y.A model for pellet size distribution in su bmerged mycelial cultures［J］. J.Theor. Biol.， 1983.105:427～452.

ぃ15］ Schügerl K, Bayer T, Niehoff J， et al. Influence of cell envir onment of the morphology of moulds and the biosynthesis of antibiotics in biorea ctors［C］. In: R.King(ed.), 2nd International Conference on Bioreactor Fluid Dynamics. 1988,229～244. Elsevier applied science. London and New York. ぃ16］ Stahmann K, Schimz K, Sahm H. Purification and characterizatio n of four extracellular 1,3βglucans of Botrytis cinereaВJ］.Journal of General Microbiolog， 1993, 139：2833～2840.