秦俊哲 魏穎杰 陳 合 呂嘉櫪

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西咸陽 712081）

金針菇ВFlammulina velutipes）Э諼斷拭潰營養(yǎng)豐富，具有防病抗癌功能，可促 進(jìn)兒童健康成長和智力發(fā)育。近年來，其消費(fèi)量迅速增加，國外金針菇生產(chǎn)已基本實(shí)現(xiàn)了工 廠化，國內(nèi)在引進(jìn)國外技術(shù)的同時(shí)也逐漸形成了一套適合國情的規(guī)?；苣晟a(chǎn)技術(shù)。但金針菇菌種生產(chǎn)仍采用固體發(fā)酵法，存在生長周期長、菌齡不一致、操作不方便等缺點(diǎn)，而以 液體菌種進(jìn)行擴(kuò)大繁殖是規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展方向。有關(guān)金針菇菌種液體培養(yǎng)技術(shù)的研究雖有一些報(bào)道［1～3］，但多以利用發(fā)酵液或菌絲體為目的，對(duì)培養(yǎng)過程中影響菌絲活性 的生理指標(biāo)研究甚少，目前尚缺乏有效控制發(fā)酵過程的生理指標(biāo)和技術(shù)參數(shù)。本文通過研究影響菌絲生長的主要生理指標(biāo)，如菌絲球數(shù)量、pH、還原糖和氨基氮含量以及酶活性與菌絲 生長活性的關(guān)系，為金針菇液體菌種工廠化生產(chǎn)過程的控制提供技術(shù)參數(shù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 ソ鷲牘驕種“金18”由武漢市新育食用菌研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 バ泵媾嘌基：PDA培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基：米粉3%，赤砂 糖1%，酵母膏1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB110μg/100mL，VB250μg/100mL 。

1.1.3 儀器與設(shè)備 YJ型超凈工作臺(tái)，江蘇省蘇州市蘇凈集團(tuán)安泰公司 產(chǎn)品；3033型恒溫培養(yǎng)箱，江蘇省東臺(tái)電器廠產(chǎn)品；YX280型手提式壓力蒸汽消毒器，上海醫(yī)療器械工業(yè)公司產(chǎn)品；SHZB型水浴恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；722型分 光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠產(chǎn)品；8002型電熱恒溫水浴鍋，北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；pHep型pH計(jì)，意大利HANNA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 斜面菌種的活化 ソ菌種接于PDA斜面培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培 養(yǎng)7d，作為下一步搖瓶培養(yǎng)的一級(jí)菌種。

1.2.2 搖瓶菌種的制作與培養(yǎng) ビ500mL三角瓶，培養(yǎng)基裝量150mL，于 121℃、0.12MPa壓力下滅菌30min，冷卻后每瓶接入3塊1cm2培養(yǎng)7d的斜面菌種，150r/min 搖床培養(yǎng)8d，培養(yǎng)溫度為25℃，每天取一瓶檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 菌球計(jì)數(shù) 吸取1mL培養(yǎng)液稀釋至10mL，取1mL稀釋液置平皿中，皿下襯黑白相間方格紙計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 pH值測定 用pH計(jì)測量培養(yǎng)液的pH值。

1.2.3.3 還原糖測定 用3，5捕硝基水楊酸法［4］。

1.2.3.4 氨基氮測定 用甲醛滴定法［5］。

1.2.3.5 羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性測定用3，5捕硝基水楊酸法［5］， 培養(yǎng)液濾液中羧甲基纖維素酶活性單位定義為1U＝1mg葡萄糖/30min·mL。

1.2.3.6 漆酶活性測定 取0.5mL13.36mM的聯(lián)苯胺作為底物，加入3.4mL 0.1M、pH4.6的 HAC緩沖液，加入0.1mL發(fā)酵濾液，于28℃下反應(yīng)30min，在600nm處測OD值。同時(shí)，以0.1mL 煮沸的發(fā)酵濾液代替原液作空白對(duì)照。培養(yǎng)液濾液中漆酶活性單位定義為1U=ΔOD/min·mL ［6］。

WX(16，241.2.3.7 蛋白酶活性測定 用Worthington法［7］，培養(yǎng)液濾液中蛋白酶活性單位定義為1U＝1mg酪氨酸/15min·mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液菌絲球數(shù)量的變化

ッ扛24h測定培養(yǎng)液的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)并觀察菌絲球形態(tài)。菌絲球數(shù)量的變化情況如圖1 所示。

ビ賞1可以看出，培養(yǎng)初期，菌絲球數(shù)量增長緩慢，培養(yǎng)第3～6天為菌絲球增長旺盛期，第7天菌絲球數(shù)量達(dá)到峰值。然后，隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)

おおおおおおおおお

ね1 金針菇液體菌種培養(yǎng)液菌絲球數(shù)量的變化

Fig. 1 Variation of mycelial pellet nos.in thefermentative liqu id of WTHXF. velutipesWX)

成分的減少及菌絲活性的減弱，菌絲生長速度開始下降。此生長曲線符合金針菇的一般生長規(guī)律。

2.2 培養(yǎng)液pH值的變化

ネ2顯示，液體培養(yǎng)期間，培養(yǎng)液的pH變化很小，基本上保持不變，在培養(yǎng)末期略有上升。這是因?yàn)榻疳樄揭后w培養(yǎng)初期菌絲分解基質(zhì)產(chǎn)生部分有機(jī)酸，培養(yǎng)末期，由于菌絲球老化 自溶產(chǎn)生氨基氮等堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液的pH略微升高。如果培養(yǎng)后期pH明顯降低，溶液渾濁產(chǎn)生泡沫，多為雜菌污染所致。該結(jié)果與劉陽等的報(bào)道［8］基本一致。

KH10*2

ね2 金針菇液體菌種培養(yǎng)液pH值、還原糖和氨基氮含量的變化

Fig. 2 Variation of pH,reducing sugar and amino nitrogen contents in th e fermentative liquid of WTHXF. velutipes J1

2.3 培養(yǎng)液還原糖及氨基氮含量的變化

ゴ油2可以看出，培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液中還原糖含量較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，還原糖含量迅速增長，培養(yǎng)中期還原糖含量變化平緩，后期又下降，第6天降至3.40g/100mL。培養(yǎng)初 期，雖然菌絲生物量不大，但分解碳源物質(zhì)的能力很強(qiáng)，還原糖的生成量大于利用量，所以此期間還原糖含量呈上升趨勢。隨著培養(yǎng)基中碳源物質(zhì)的消耗和菌絲球數(shù)量的增長，培養(yǎng)后 期還原糖含量迅速下降。

ヅ嘌液中氨基氮含量在培養(yǎng)前期變化不大，增長趨勢比較平緩，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其含量逐漸增加；培養(yǎng)后期氨基氮含量迅速增長，第7天達(dá)到11.10mg/100mL。這是由于培養(yǎng)后 期部分菌絲體蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基氮類物質(zhì)及菌絲球老化自溶釋放出氨基氮類物質(zhì)所致。

2.4 培養(yǎng)液酶活性的變化

ネ3顯示，培養(yǎng)1～3d，培養(yǎng)液中纖維素酶活性較低，第3天后，纖維素酶活性逐漸增加，第5～6天，纖維素酶活性基本上保持在1.10U左右，為平臺(tái)期。金針菇依靠自身分泌的各種 酶分解基質(zhì)中的碳源物質(zhì)來提供生長發(fā)育所需要的能量和營養(yǎng)，而纖維素是一種高分子結(jié)構(gòu)的碳源，必須在纖維素酶作用下才能夠分解［9］。因此，菌株纖維素酶活性的高低 可反映菌株活性的強(qiáng)弱。

テ崦富钚緣腦齔け冉匣郝，其變化不明顯，峰值出現(xiàn)在第6天，之后，漆酶活性的變化漸 趨平緩，與金針菇的生長曲線基本吻合。本試驗(yàn)中漆酶活性可達(dá)0.017U。漆酶是降解木質(zhì)素 大分子物質(zhì)的主要酚氧化酶，它能加速木質(zhì)素芳香族高分子化合物的分解，提供菌絲所需的營養(yǎng)［9］。胞外漆酶活性越高，菌株分解能力越強(qiáng)。因此，漆酶活性可作為反映金 針菇菌絲細(xì)胞活性的指標(biāo)。若漆酶活性強(qiáng)，則底物分解快，菌絲生長速度加快。此外，漆酶代謝所產(chǎn)生的醌類物質(zhì)的增加，還可以增強(qiáng)菌種的抗病能力，抑制雜菌污染。本試驗(yàn)漆酶活 性的變化不明顯，這與培養(yǎng)基中缺乏木質(zhì)素成分有關(guān)。

ネǔＨ銜蛋白酶是在基質(zhì)中可吸收氮源缺乏的情況下，為了獲得蛋白質(zhì)中的氮素而產(chǎn)生的［9］，而蛋白酶的主要作用就是分解肽鍵，使蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白胨、多肽 或氨基酸等

WX(20。2物質(zhì)［10］。圖3顯示，金針菇液體菌種培養(yǎng)液中蛋白酶的變化不大，趨勢比較平緩，峰值出現(xiàn)在第6天，酶活性為0.17U。這是由于在金針菇菌絲 生長過程中，對(duì)氮源的利用先于碳源，而蛋白酶是在有氮素需求的菌絲體中被大量誘導(dǎo)生成的。這說明金針菇的生長對(duì)氮源的需求量較低。 プ芴謇純矗三種酶的變化趨勢基本一致。培養(yǎng)初期，為菌絲的緩慢生長期，酶活性較低。 其后菌絲開始迅速增殖，從而分泌出大量的酶，基質(zhì)分解速度加快，酶活性增大。第6天后，酶活性不再增加，基本上保持不變，達(dá)平臺(tái)期。培養(yǎng)后期，菌絲球逐漸進(jìn)入衰退期，酶活 性亦呈下

ね3 金針菇液體菌種培養(yǎng)液酶活性的變化

Fig. 3 Variation of enzyme activity in thefermentative liquid o f WTHXF. velutipesWX)

降趨勢?？梢姡疳樄矫富钚缘淖兓c其生長趨勢基本相符。

2.5 菌絲球形態(tài)的變化

ソ鷲牘揭禾寰種培養(yǎng)過程中，對(duì)菌絲球的形態(tài)觀察結(jié)果表明，第1～3天為菌種塊萌發(fā)定植 期，培養(yǎng)液顏色清亮，菌絲片段增多，出現(xiàn)分枝；第4～6天，菌種塊沉沒，培養(yǎng)液中菌絲球 由小變大，邊緣呈絨毛狀，數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)液變稠；第7天，菌絲球密度最大，但菌絲球顏色泛黃；此后，菌絲球邊緣變得光滑，密度漸減，菌絲球自溶加快，培養(yǎng)液變得渾濁。 此觀察結(jié)果與金針菇液體菌種培養(yǎng)液中的菌絲球數(shù)量、pH、還原糖和氨基氮含量及纖維素酶、漆酶、蛋白酶活性的變化情況基本一致。

4 結(jié)論

プ酆弦隕涎芯拷峁可以看出，在金針菇液體菌種培養(yǎng)過程中，菌絲球數(shù)量在第7天達(dá)到峰 值，但酶活性一般在第6天最高，這說明酶活性的峰值與菌絲球數(shù)量的峰值不是同時(shí)出現(xiàn)的 ，以酶活性的峰值作為液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)的參數(shù)比較合理。而且，在第6天，培養(yǎng)液中的還原糖含量也開始下降，氨基氮含量又有所上升，這表明菌絲球活性最強(qiáng)。繼續(xù)培養(yǎng)，則菌絲 球活性下降，說明培養(yǎng)終點(diǎn)應(yīng)控制在第6天。因此，要想獲得質(zhì)量好、產(chǎn)量高的液體菌種，將菌絲球的形態(tài)觀察結(jié)合培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量、pH值、還原糖和氨基氮含量，以及酶活性 的測定作為控制指標(biāo)，是一種有效而可靠的監(jiān)測方法。本試驗(yàn)結(jié)果為金針菇液體菌種培養(yǎng)過程的控制提供了比較可靠的技術(shù)參數(shù)，若以該參數(shù)作為液體菌種實(shí)際生產(chǎn)中的控制指標(biāo)，尚 有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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