蘭 進 賀秀霞 湯以佳 徐錦堂 朱永懿

（中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學藥用植物研究所, 北京, 100094;

中國農(nóng)業(yè)科學院原子能利用研究所, 北京,100094）

摘 要 ：用3H一葡萄糖對紫萁小菇進行氚標記，然后用標記的紫萁小菇伴播天麻種子，觀察發(fā)現(xiàn)標記紫萁小菇僅由天麻胚柄狀細胞侵入，在天麻種胚細胞中同化的標記化合物由細胞壁進入并由胞壓運輸?shù)郊毎麅?nèi)，形成原球莖后同化標記物由維管組織運輸。

關(guān)鍵詞 ：天麻種子; 標記紫萁小菇; 放射性自顯影

前言:

天麻（Gastrodia elata Bl．）屬蘭科（Orchidaceae）非自養(yǎng)型植物。其種子構(gòu)造簡單，無胚乳及其它營養(yǎng)貯備，僅由胚及種皮構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)天麻種胚細胞中含有一些多糖及脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，但不足以提高種子萌發(fā)的營養(yǎng)。試驗證明，無外源營養(yǎng)供給，天麻種子不能發(fā)芽，蜜環(huán)菌對天麻種子萌發(fā)有明顯的抑制作用。徐錦堂等從天麻發(fā)芽原球莖中分離到12種可供天麻種子發(fā)芽的萌發(fā)菌菌株，其中確認紫萁小菇（Mycena osmundicola Lange）菌是最優(yōu)良的一種，這一突破性的進展，使天麻種子發(fā)芽率提高30-40％。天麻有性繁殖研究也進入了一個新階段。徐錦堂等利用光學顯微鏡及電子顯微鏡對天麻消化紫萁小菇的過程進行了大量觀察研究。這些工作多是建立在雙方相互作用解剖特征基礎(chǔ)上，缺少對作用雙方物質(zhì)運輸途徑的研究。本文在前人研究基礎(chǔ)上，采用連續(xù)切片進行光鏡放射性自顯影觀察，追蹤標記紫萁小菇及同化產(chǎn)物在天麻種胚中的軌跡，了解標記物在天麻種胚及原球莖中積累運輸情況，為系統(tǒng)地揭示天麻生長發(fā)育規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 同位素標記化合物

H一葡萄糖［D一（6-H-glu）］，由中國科學院上海核技術(shù)研究所提供，比活度30Ci／mmol。

1.2方法

1.2.1菌種標記培養(yǎng)

母種菌種培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，水1000ml,按常規(guī)配制，pH5.5。經(jīng)高壓滅菌后，在無菌條件下，將培養(yǎng)基分裝無菌試管中，每管2 ml，25℃放置2d。無菌條件下溶化加入H一葡萄糖，引入劑量50μci／ml，搖勻，擺成斜面培養(yǎng)基。用60Coγ輻照滅菌。25℃培養(yǎng)2d，確認無雜菌污染后，接入紫萁小菇菌種，25℃培養(yǎng)，15d后轉(zhuǎn)接二級菌種。

樹葉菌種培養(yǎng)：將青杠樹落葉洗凈，擺放到培養(yǎng)皿中的海棉上，加水，高壓滅菌后，接入標記的一級菌種，25℃培養(yǎng)，20d后可播種。

1.2.2標記紫萁小菇伴播天麻種子 實驗所用天麻種子采自藥用植物研究所真菌室經(jīng)人工授粉結(jié)的果實。在無菌條件下，將天麻果抖出種子，播種到染有紫萁小菇的菌葉上。

1.2.3樣品制備

光鏡樣品制備：取被標記紫萁小菇侵染的天麻種子及由種子萌發(fā)形成的原球莖，用水反復沖洗．用5O% EDTA浸洗2min，再流水沖洗。分別用FAA液固定24h，經(jīng)清洗，系列梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，切片厚度7～8μm。切片經(jīng)禱片、脫蠟、復水后，移入暗室涂布乳膠。

自顯影制備：暗室紅燈下，取定量的核一4乳膠（北京401研究所研制），置于無離子水洗凈的乳膠杯中，以一定濃度水楊酸鈉溶液作增感劑，在42℃恒溫水浴中攪拌15min，靜止片刻．在乳膠涂布箱中，用涂布法在已脫蠟的切片上涂布核乳膠膜，晾干，置切片于暗盒中，加硅膠干燥袋，密封，置4℃冰箱中曝光20d。

顯影、定影：切片曝光后，用D-19b顯影液顯影3min，停影后，用F-5酸性堅膜定影液定影20min，流水沖洗，稍晾干，經(jīng)系列梯度酒精脫水，同時用番紅一固綠二重染色，最后，用光學樹脂封片，待觀察。

6. 結(jié)果與分析

標記紫萁小菇伴播天麻種子后，在菌絲侵入初期，標記物大量集中分布于天麻胚柄狀細胞中，表明紫萁小菇菌絲僅由天麻胚柄狀細胞侵入胚體，標記菌絲形成菌絲結(jié)出現(xiàn)在胚柄狀細胞上部2～3層原胚細胞中，同時發(fā)現(xiàn)顯影銀粒在胚柄狀細胞以上的原胚細胞和頂端分生細胞中，在原胚細胞中顯影銀粒多分散在多糖顆粒上，表明胚柄狀細胞上部2～3層原胚細胞具有消化、分解萌發(fā)菌的能力并將其同化產(chǎn)物通過細胞壁及胞壓運輸?shù)缴喜吭呒毎绊敹朔稚毎小Ｓ^察還發(fā)現(xiàn)在胚柄狀細胞上部4～5層原胚細胞中，不形成菌絲結(jié)，紫萁小菇菌絲被完全消化，在這些細胞中有大量顯影銀粒存在，在胚頂上層原胚細胞分解、消化吸收，被同化的標記物由胞壓作用，通過細胞間傳遞達到頂端分生細胞中。分生細胞獲得營養(yǎng)，分裂旺盛，胚體膨大，突破種皮而萌發(fā)，形成原球莖。原球莖分化產(chǎn)生營養(yǎng)繁殖莖，并分化出維管組織，在新形成的維管組織中發(fā)現(xiàn)大量顯影銀粒，表明隨著種胚的發(fā)育，維管組織的形成，天麻種胚消化萌發(fā)菌獲得的營養(yǎng)物質(zhì)是通過維管組織進行運輸，以滿足其生長的需要。

3.討論

通過放射性自顯影觀察標記紫萁小菇同化物的蹤跡，表明天麻胚柄狀細胞具有分解、消化菌絲的功能，當分生細胞開始分裂后，種胚頂端分生組織中已云集大量同化的標記化合物，在天麻種胚沒有形成原球莖前，同化紫萁小菇的營養(yǎng)物質(zhì)靠細胞壁及胞壓作用，進行傳遞和輸送，當頂端分生細胞開始分裂，突破種皮而萌發(fā)，形成原球莖，隨著組織的分化，同化標記物由維管組織運輸，從理論上進一步證明天麻種子萌發(fā)靠同化侵入的紫萁小菇獲得營養(yǎng)。在新形成的營養(yǎng)繁殖莖維管組織中也發(fā)現(xiàn)了許多顯影銀粒，說明紫萁小菇不僅在天麻種子發(fā)芽及原球莖形成時供給營養(yǎng)，而在分化出營養(yǎng)繁殖莖及營養(yǎng)繁殖莖生長階段，都需要從萌發(fā)菌獲得營養(yǎng)。這些同化的標記物如何參與天麻種子萌發(fā)與原球莖形成的新陳代謝過程及其超微結(jié)構(gòu)的變化還有待于借助電子顯微鏡放射性自顯影技術(shù)進一步觀察研究。

參考文獻

冉硯珠，徐錦堂. 1988.蜜環(huán)菌抑制天麻種子發(fā)芽的研究.中藥通報, 13（10）15～17

徐錦堂，冉硯珠，郭順星. 1990.天麻種子發(fā)芽營養(yǎng)來源的研究.中國醫(yī)學科學院學報, 12（5）：431～434

徐錦堂，郭順星. 1989.供給天麻種子萌發(fā)營養(yǎng)的真菌-紫萁小菇. 真菌學報, 8（3）：221～226

徐錦堂，牟春，冉硯珠. 1990.天麻種子萌發(fā)動態(tài)及紫萁小菇菌絲侵入的細胞學觀察. 中國醫(yī)學科學院學報, 12（5）：313～317

徐錦堂，牟春. 1990.天麻原球莖生長發(fā)育與紫萁小菇及蜜環(huán)菌的關(guān)系. 植物學報, 32（l）：26～31