雙孢蘑菇的遺傳和育種

A.S.M.Sonnenberg，荷蘭霍爾斯特蘑菇試驗站

陳美元譯自《Mushroom Science》15(1): 25-39, 荷蘭, 2000.5,王澤生校。

摘要：在過去幾十年里選育雙孢蘑菇的成果甚為匱乏。自從1980年育出第一個雜交種以后便沒有真正的新菌株問世。然而，人們已經在生活史、遺傳變異來源的可利用性以及育種的有效工具方面獲得了許多進展，這些都是產生新菌株的前提。本文回顧了這些前提條件的發(fā)展情況，著重論述新的進展。

1 前言

直到最近幾十年雙孢蘑菇的生活史才被完全揭開，顯示出在育種上的潛在價值。但從那以后，關于育種程序的報道卻很少出現(xiàn)。從通過育種獲得第一個雜交菌株并推向市場以后至今，二十年已經過去了。現(xiàn)在，多數(shù)菌株要么與第一個雜交種相同，要么非常接近。（譯者注：此結論有失偏頗，比如我國于89年育成的雜交新菌株AS2796經美國Sylvan蘑菇公司鑒定，認為在遺傳、栽培特性與質量性狀等方面與U1系列都有顯著的差異。）雖然新的雜交種在產量的提高上有所貢獻，但世界性的生產發(fā)展卻是由于其它原因，即栽培面積的增加、栽培技術的完善、添加劑的使用和堆料的改進。

有人將因此認為回顧雙孢蘑菇的育種不是一個艱巨的任務。但這些印象在某種程度上是不真實的。雖然最近沒有真正的新菌株出現(xiàn)，但研究工作已取得相當大的進步，使得新菌株看來象是很快就會出現(xiàn)。因此，本篇主報告將重點論述與育種、育種技術及育種戰(zhàn)略有關的遺傳學新進展。

選育新菌株的前提條件是：1）生活史的知識，2）作為變異來源的菌株的收集，3）有效的育種方法，包括評定感興趣性狀的可靠且快速的方法。新菌株缺乏的主要原因是過去這些條件都沒有得到充分滿足。尤其是雙孢蘑菇具有獨特的生活史，它妨礙了有效的育種并限制了菌株的遺傳多樣性，成為影響育種的主要障礙。我將盡量回顧有關論文的關鍵內容并強調最新進展。

2 雙孢蘑菇的生活史

雙孢蘑菇的生活史在過去已得到很好的研究（Raper et al.,1972;Elliott,1972）。菌株的親和性由一個交配型因子控制，可育性需要不同的等位基因?？捎臒o性菌絲體由一個細胞網絡組成，每個細胞含有不定數(shù)量的兩種不同遺傳型的核，具有相反的交配型（異核體）。在擔子，即菌褶上能產生孢子的特化細胞中，核的數(shù)量減為兩個，每種交配型各一個。核融合后進行正常的減數(shù)分裂，大部分擔子產生兩個孢子，每個包含兩個非姐妹核(n+n)。出菇試驗表明這些單孢培養(yǎng)物能夠產生子實體，即它們都含有兩種交配型。除了這種交配型基因的異等位現(xiàn)象，雙孢蘑菇看來通常還保留了其親本的異質性(Royse & May,1982; Summerbell et al.,1989)。這可以這樣解釋：假定有一個機制偏愛非姐妹核的配對，那么減數(shù)分裂中就存在一個低重組率。前者由Evans(1959)的顯微觀察所支持，鏡檢顯示減數(shù)分裂紡綞體形成的結果是孢子的80%結合了非姐妹核。多個報道也表明雙孢蘑菇存在一個反常的低重組率(Royse & May,1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993)。只有少數(shù)擔子產生3或4個孢子，這類孢子的大部分是單倍體(n)，不結菇或只產生有限數(shù)量的子實體。這類孢子的單孢培養(yǎng)物產生的無性菌絲體，每個細胞（同核體）也包含數(shù)量不定（遺傳相同）的核。這種次級同宗配合生活史在所有的商品菌株和來自Alberta、加利福尼亞海岸及法國的野生分離株中均有發(fā)現(xiàn)(Kerrigan,1996)。雙孢蘑菇的其它特性是，除了同核體和異核體中不定數(shù)目的核以外，異核體中還缺乏鎖狀聯(lián)合。獨特的生活史及同核體和異核體間缺乏差異成了育種的一個嚴重的障礙。

最近，加利福尼亞發(fā)現(xiàn)了一個四孢擔子占絕對優(yōu)勢的稀有類群(Callac et al.,1993)。多數(shù)單孢培養(yǎng)物同核且不育表明它們的生殖方式是異宗配合。該類群與商業(yè)及野生分離的雙孢菌株均可相互雜交。遺傳分析表明該四孢種和雙孢種間甚至存在著保守的遺傳連鎖，也就是說，二者基因組標記的位置和序列相類似(Callac et al.,1997)。由于生殖方式的差異，進行了一次品種身份測試，即雙孢蘑菇與四孢蘑菇雜交（異宗配合）對雙孢蘑菇與雙孢蘑菇雜交（次級同宗配合）。四孢種產生同核子代表明其繁殖方式趨于遠系繁殖。觀察到的結果支持了這一點，即四孢變種和雙孢/四孢雜交種減數(shù)分裂的重組率要高于雙孢蘑菇(Callac et al.,1997; 1998; Sonnenberg et al.,1996b)。Imbernon等人（1996）已把決定擔孢子數(shù)目的遺傳因子初步定位于染色體I上，最近研究結果表明該決定因子的四孢等位基因也存在于一個法國類群(Callac et al.,1998)。品種間雜交育種表明四孢表型是顯性的，具有多樣的滲透性(Imbernon et al.,1996)，因此能轉移到商品菌株上。這無疑將推動育種的進程。

所獲得的生活史及遺傳方式的知識表明育種前提條件之一已得到滿足，雙孢蘑菇的育種具備了很好的可能性。

3 新種質

直到70年代后期，靠機率篩選仍然是改良菌株的主要手段。Royse 和May（1982）查明所搜集到的商品菌株的遺傳表型數(shù)目非常有限。雖然存在這個缺點，F(xiàn)ritsche還是把這些傳統(tǒng)栽培菌株應用于有較大風險的育種計劃之中(Fritsche,1984)，最終育成第一批雜種（Horst U1和U3）而聞名世界。然而，使用同樣的傳統(tǒng)菌株作進一步的育種努力卻沒有獲得任何新菌株(Fritsche, 未發(fā)表結果)。大部分當今的雜交菌株要么與這兩個雜交種相同，要么非常相似(Loftus et al.,1988; Sonnenberg et al.,1999; 本文)。Royse 和May(1982)以及Kerrigan(1990)已查明，雙孢蘑菇栽培菌株和收集的培養(yǎng)物表現(xiàn)出較低的遺傳變異性，這些保存菌株的大部分可能來自不到20個的歐洲獨立菌株。育種對變異來源的需要及加利福尼亞非歐洲種質的發(fā)現(xiàn)(Kerrigan & Ross,1989) 使促進雙孢蘑菇新種質發(fā)現(xiàn)、描述、保藏的蘑菇屬種質工程（ARP）得以啟動（Kerrigan,1996）。自從ARP菌株1995年放開以后，現(xiàn)在很多育種小組都在使用它們。ARP菌株中的遺傳變異與栽培或傳統(tǒng)菌株中的遺傳單一性具有很大的不同(Kerrigan,1995; Sonnenberg et al.,1999;本文)。這些菌株還展示了當今雜交種中未發(fā)現(xiàn)的許多令人感興趣的特性。已有報道表明一些野外收集菌株對白色雙孢蘑菇栽培中已知的三種主要的病原菌（圖1）表現(xiàn)出低敏感性或抗性。例如Dragt等人（1995）描述了ARP中的兩個菌株對干泡病的病原菌菌生輪枝菌具有部分的抗性。這些菌株的低敏感性結合農場嚴格的衛(wèi)生條件足以防止大規(guī)模干泡病的暴發(fā)。在栽培品種中導入部分抗性也能降低殺真菌劑特別是施保功和百菌清的使用。

圖1 蘑菇生產中的三種主要病害。A：干泡?。ㄕ婢纳喼?；B：法蘭西病毒病（雙孢蘑菇病毒）；C：細菌性斑點?。ㄍ欣辜賳伟麠U菌）

另一種能在蘑菇生產中造成相當大損失的病害是托拉斯假單胞桿菌引起的細菌性斑點病(Raniey et al.,1992)。Olivier等人（1997）應用一種標準方法評估雙孢蘑菇菌株對斑點病的抗性，并在法國野生類群中發(fā)現(xiàn)數(shù)量可觀的野生菌株對該病表現(xiàn)出低敏感性。

食用菌中唯一研究較多的病毒病是雙孢蘑菇病毒病或法蘭西病(Van Zaayen,1979)。該病毒的基因組已被分割并發(fā)現(xiàn)它由至少10段主要的dsRNA構成（Harmsen et al.,1989）。ARP菌株中沒有顯示法蘭西病典型的dsRNA帶型。許多ARP菌株有新的帶型，表明存在新的病毒類型(Sonnenberg et al.,1995)。然而大部分ARP菌株似乎沒有dsRNA。當用感染病毒的商品菌株同核體與沒有病毒的野生菌株的同核體雜交以轉移法蘭西病的病毒時，發(fā)現(xiàn)了令人感興趣的結果。許多雜交種保留了病毒的dsRNA，但有時沒有或幾乎沒有任何癥狀(Sonnenberg et al.,1995)。而更令人感興趣的是有的雜種不能通過這種途徑感染，重復的嘗試也無濟于事。這些結果表明一些ARP菌株可能對商品菌株病毒病具低敏感性和/或抗性。

發(fā)現(xiàn)商品菌株的許多栽培特性會發(fā)生變化(Sonnenberg et al.,1996b)。這些特性是走菌時間或通風誘導后的菇蕾形成時間。蘑菇栽培的最適溫度也會變化。上述表明第二個前提條件即育種變異來源的可利用性也已得到滿足。

4 遺傳標記的發(fā)展

在過去的20年里向前邁出的重要一步是遺傳標記的發(fā)展和應用。在探索雙孢蘑菇的遺傳構成，了解它的遺傳方式，獲得更多對菌株起源及其相互關系的認識等方面，這些標記已變得非常重要。首先，這些標記在任何育種工程中已成為不可或缺之物。標記可以預測某些遺傳因子的遺傳方式，這些遺傳因子或與性狀相關，或與包圍它的區(qū)域緊密連鎖。這使得在許多情況下不必檢測某一性狀的遺傳，因此加快了育種的進程。

第一個標記被用來研究雙孢蘑菇的性別。它們是表型特征如結菇能力（可育與不育）、營養(yǎng)缺陷、孢子梗顏色及“野生”形態(tài)(Miller & Kananen,1972; Raper et al.,1972;Miller et al., 1974; Elliott,1972)。雜交種中這些表型的表達及在單孢子代中的遺傳的研究無疑奠定了雙孢蘑菇性別區(qū)分的基礎，因此揭示了其育種的潛力。然而這些標記只能在子實體中檢測。隨著基因產物（蛋白）或DNA序列本身作為遺傳標記的引入，一個實用且非常強大的技術在育種中變得可行。這些標記的優(yōu)點是：（1）數(shù)目巨大；（2）表達和檢測與生活史分開，從而在無性菌絲中可以檢測；（3）共顯性，即在雜交中可以檢測雙個等位基因。Royse 和 May（1982）首次引入了這些標記之一，即同工酶。同工酶是具有相同反應特性而氨基酸組成稍有不同的一類蛋白。這些差異導致電泳遷移的不同，因此在聚丙稀酰胺凝膠上產生不同的帶型。Royse 和May證明了同工酶在菌株分型和選擇性育種中的用途(Royse & May,1982a,1982b)。作為DNA標記的第一個技術是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP, Botstein et al., 1980)。該技術使用限制性內切酶，每種酶識別雙鏈DNA上的單一位點，并在這些位點上斷開雙鏈。產生的片段可按長度在凝膠上分開并轉移到尼龍膜，然后用標記探針進行雜交，這些探針是一些短的DNA片段，可與尼龍膜上的互補序列結合。獨特帶型顯示的限制性片段數(shù)目和大小的不同反映了DNA序列的差異。由于有許多不同的限制性酶和甚至更多的可能的探針，該技術產生的標記的數(shù)量接近無限。Horgen和Anderson小組第一次在傘菌研究中引入該技術(Anderson et al., 1984; Castle et al.,1987;1988; Summerbell et al., 1989)。該技術用于分離同核體時，看來是個強大而可靠的工具(Kerrigan et al.,1992)，并被用來構建雙孢蘑菇的遺傳圖譜(Derrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996a)。除了RFLP，人們還發(fā)明了一個甚至更有效的方法來檢測DNA序列的差異，即多聚酶鏈式反應(PCR, Mullis et al.,1986)。PCR是合成和擴增DNA的一種體外方法，待擴增的序列被短單鏈DNA序列限制在特定區(qū)域。該項技術非常靈敏而且迅速，原則上只需幾個DNA分子，通過循環(huán)反應，在數(shù)小時內可擴增出相當?shù)臄?shù)量，通過染色可在凝膠上直接看到條帶。標準PCR的前提條件是要知道待擴增片段的序列。等位基因間的差異如插入和缺失將產生不同長度的PCR片段。堿基替換造成等位基因位點的特異性，據(jù)此可設計出等位基因特異引物。這種PCR即通常所說的SCAR（確定序列擴增區(qū)域，Paran & Michelmore,1993）。即使不知道某一生物體的任何序列，PCR也可以用來產生遺傳標記，即使用很短（10bp）的引物可進行隨機擴增(隨機擴增的多態(tài)性DNA；Williams et al.,1991)。Khush等人（1992）表明這些類型的標記可用于雙孢蘑菇菌株分型及分離分析。

5 標記中的一個特殊種類――重復序列

遺傳分析中功能最強的標記來自于重復序列。它們可以很短，也可以是整個基因；每個單倍體基因組中可以有幾個拷貝，也可以有成百上千個拷貝。使用重復序列作標記的優(yōu)點是單個探針可以監(jiān)控許多位點，因此在菌株作圖和指紋分析中它是一個強有力的工具。

所知的一類重復序列是微衛(wèi)星或稱簡單序列重復（SSR）。微衛(wèi)星是銜接排列的1-5個核苷酸重復單元，單元的數(shù)目從2到數(shù)千不等。它們分布于包括真菌在內的所有真核基因組中(Tautz & Renz,1984)。微衛(wèi)星中重復單元的數(shù)目是高度可變的，取決于復制滑動、不平等互換或其它未知的機制(Levinson & Gutman,1987; Schlotterer & Tautz,1992; Strand et al., 1994)。微衛(wèi)星主要用于PCR反應，可根據(jù)微衛(wèi)星序列使用引物，如果微衛(wèi)星的不同拷貝較為靠近，其間的DNA就可以被擴增出來。另外也可以使用微衛(wèi)星兩側的引物，因為微衛(wèi)星的長度是可變的，當不同菌株的DNA作為目標時，微衛(wèi)星兩側的引物可產生大小不同的條帶。一個好的例子是最近發(fā)表的鷹嘴豆(Cicer arietinum L.)圖譜，標示了120個所謂的序列標志微衛(wèi)星位點（STMS）(Winter et al.,1999)。微衛(wèi)星已用于雙孢蘑菇基因組的研究（與M.Loftus和 J.Labarere的個人通信），但尚未發(fā)表任何使用情況的數(shù)據(jù)。

微衛(wèi)星的長度變化最近由于完全不同的原因已成為一個熱門的研究課題。人類數(shù)目漸增的遺傳失調與轉錄或非轉錄序列三核苷酸重復單元的反常擴增有關(Dijan,1998)。其在真菌中是否有類似的作用不得而知，但最近有報道在Podospora anserina中微衛(wèi)星長度與一個報告基因的表達存在連鎖關系(Khahnobish et al.,1999)。

5.1 可移動的遺傳因子

真核基因組中研究最透徹的重復序列中有些是轉座因子或稱轉座子。它們是可移動的遺傳因子，靠與非同源區(qū)域的結合可以漫延到整個基因組。在真核基因組它們可以極高的拷貝數(shù)存在，在果蠅基因組中占到10%，而在某些植物基因組中超過50%(Freeling,1984)。最近在絲狀真菌中也發(fā)現(xiàn)了轉座子(Oliver,1992)。真核轉座子可根據(jù)它們的轉座方式細分為兩類。I類轉座子通過RNA介導轉座并通常編碼許多基因，其中總有一個是反轉錄酶基因(Boeke & Corces,1989)。II類轉座子轉座時需要單個蛋白，比如轉座酶，它在供體和目標DNA剪接過程的處理中起作用(Plasterk,1995)。盡管以非復制方式轉座，II 類轉座子也可以靠從已復制的DNA轉座到尚未復制的DNA或同源姐妹染色單體間的互換來增加數(shù)量(Plasterk, 1995)。兩種類型的轉座子已在真菌中發(fā)現(xiàn)（請看近期回顧：Daboussi & Capy,1997; Kempken & Kuck, 1998）。

近來在雙孢蘑菇中已發(fā)現(xiàn)其它真菌中描述過的轉座子的大多數(shù)類型。實際上，雙孢蘑菇是被描述過這些可移動因子的第一個擔子菌(Daboussi & Capy, 1997; Sonnenberg et al., 1999)。

II類轉座子中的一個成員Abr1是雙孢蘑菇中所描述的第一個可轉座因子(Sonnenberg, 1999)，它是一個300bp的短重復序列，兩側由11bp的反向重復序列包圍。商品菌株中每個單倍體基因組約有15個拷貝。短序列和實質編碼區(qū)長度的缺乏表明Abr1本身并不編碼轉座酶，其活動性依賴于定位在另一條染色體上具轉座活性的一種轉座酶，但沒有發(fā)現(xiàn)有關這種轉座酶的任何證據(jù)。子代分析顯示Abr1拷貝有一個正常的分離，表明沒有發(fā)生有效的轉座。這使得該重復序列在育種和后面即將談論的菌株間的關系研究上成為非常有用的標記。

我們最近還發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇基因組中I類回復轉座子的兩個成員。多數(shù)這種類型回復轉座子的典型特征是存在長末端重復序列（LTR）和兩個開放讀框（ORF）。第一個ORF編碼的一個基因與逆轉錄病毒中編碼病毒粒子外殼的gag基因具有同源性。

第二個ORF與逆轉錄病毒的pol基因具有同源性。該開放讀框產生病毒基因組復制及移入宿主基因組所需的多種蛋白。這些I類回復轉座子本身也可根據(jù)序列相似性及開放讀框上的基因序列細分為兩組。第一組命名為Tyl/copia，第二組Ty3/gypsy，都是在這二組的第一個轉座子發(fā)現(xiàn)之后命名的。

圖2 雙孢蘑菇中發(fā)現(xiàn)的第一個回復轉座子的示意圖。圖中多蛋白基因似有缺失，加上嚴重的甲基化作用，表明該轉座子不是活動的。

雙孢蘑菇發(fā)現(xiàn)的第一個回復轉座子命名為Tab1（Transposon of A.bisporus），屬于Tyl/copia組。它與植物中首次發(fā)現(xiàn)的回復轉座子之一煙草Tnt轉座子有很高的相似性(Grandbastien et al.,1989)。其LTR的長度為260bp，兩個開放讀框（圖2）被鑒定為編碼前面提到的gag 和pol基因。商品菌株中發(fā)現(xiàn)了Tab1的一個近乎完整的拷貝（4037bp），命名為Tab1-1。Tab1-1與同組其它的LTR回復轉座子的聯(lián)合比較表明編碼反轉錄酶的pol基因區(qū)域中有近600bp的缺失。用Tab1-1作探針在商品菌株中可見到多條帶，表明Tab1以多于一個拷貝的形式存在。我們分析了兩個包含Tab1序列的其它基因組克隆，兩個克隆中均發(fā)現(xiàn)被截短的代表部分pol基因的Tab1拷貝。這些Tab1拷貝的切斷看來是由于其它可轉座因子的插入。數(shù)據(jù)庫檢索揭示第二因子與來自口蘑屬Tricholoma nauseosum的一個未發(fā)表的可轉座因子及稻枯病真菌Magnaporte grisea基因組中發(fā)現(xiàn)的回復轉座子MAGGY高度相似(Farman et al., 1996)。雙孢蘑菇中發(fā)現(xiàn)的序列命名為Tab2，是依照它與Ty3/gypsy回復轉座子的一個成員MAGGY的相似性。在兩個基因組克隆分析中，Tab1被Tab2 3’端的插入打斷，該3’端包含部分pol基因（整合酶）和一個842bp的LTR。當Tab2 序列被用作探針時，在包含商品菌株DNA的Southern印跡中可見到大量的條帶，表明該轉座子以高拷貝數(shù)存在。對其它幾個包含Tab2 序列基因組克隆的分析再次揭示只有Tab2 3’末端或LTR序列的存在。在白色雙孢蘑菇中Tab2 是否存在一個全長的拷貝目前尚未得知。

以上所述表明雙孢蘑菇基因組包含多數(shù)真核基因組中發(fā)現(xiàn)的LTR回復轉座子的兩種類型，且至少所分析的拷貝是不完整的。在描述過這些因子的首批擔子菌中，雙孢蘑菇是其中之一。序列聯(lián)合比較顯示Tab1的不同拷貝間存在高同源性（>96%），多數(shù)序列差異（85%）是由于GC向AT的轉換。這表明在雙孢蘑菇中一個突變機制可能已激活，該機制類似于粗糙脈孢菌中首次描述的RIP（重復誘導的點突變）（Selker,1990）。RIP是探測并通過多個GC向AT的轉換有效改變基因組復制的一個機制。重復單元不同拷貝間因而發(fā)生的序列轉換阻止了可能存在的危險的異常重組并同時滅活轉座子。不同Tab2拷貝相關區(qū)域間的序列聯(lián)合比較揭示了序列的高度保守性，但基于轉座的序列轉換更少報道。基因組中重復序列可被改變的另一個已知的機制是Ascobolus immersus中所描述的MIP（減數(shù)分裂前的甲基化誘導）(Goyon & Faugerton,1989)。該機制與已復制序列嚴重的胞嘧啶甲基化有關，是滅活轉座子的另一個途徑。檢測序列是否被甲基化的一個有效方法是利用對甲基化敏感性不同的一對限制性內切酶。比如限制酶HpaII和MspI，均識別序列CCGG，而當?shù)诙€胞嘧啶被甲基化時，HpaII不再消化該位點而MspI卻對甲基化不敏感。用Tab1-1作探針，通過Southern印跡檢測經HpaII和MspI消化過的商品菌株DNA，可發(fā)現(xiàn)甲基化的清晰證據(jù)。從帶型上可看出很大的不同，經HpaII消化的基因組DNA得到大分子量的帶而用MspI時得到的帶分子量較小。用Tab2作探針時得到相同的結果。類似RIP的突變及嚴重的甲基化均表明兩種類型的轉座子在已檢測的商品菌株基因組中都是不活動的。然而，當檢測來自同一菌株的不同批菌絲體時，發(fā)現(xiàn)Tab1的甲基化圖譜是高度可變的，這一點令人感興趣。甚至在同一菇床上隨機分布的不同子實體間也可見到帶型的差異。是什么引起可變的甲基化作用，是否對表型有影響還不得而知。

應用根據(jù)Tab1的LTR區(qū)域設計的引物在一個野生菌株同核體中擴增出一個4660bp的片段，部分序列分析顯示該拷貝在pol基因中沒有缺失發(fā)生。由于該拷貝比商品菌株中發(fā)現(xiàn)的Tab1-1拷貝長，所以該回復轉座子可能是完整無缺的。Southern分析表明這個野生菌株的同核體中Tab1只有單個拷貝。當用限制酶HpaII和MspI進行消化時，發(fā)現(xiàn)帶型沒有差異，表明野生菌株中的單拷貝沒有被甲基化。這與其它報道中只有重復序列被甲基化的情況相符(Faugerton et al.,1990)。目前我們正在測試命名為Tab1-4的該Tab1拷貝是否可被轉錄，如果可以，則可能仍有活性。

最后的一個重復序列作為一個EcoRI消化的片段從蘑菇的基因組中被幸運地克隆出來(Castle et al., 1987)。使用該片段作探針在雙孢蘑菇、大肥菇、A.subfloccosus和A.pattersonae中可見到中度重復序列(與Kerrigan的個人通信)。目前尚未確定該重復序列的明確界限，并且在數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與任何序列具有同源性。最新的重復序列被命名為Abr3。

6 系統(tǒng)發(fā)育和重復序列；現(xiàn)代雜交種的起源

重復DNA和可轉座因子的遷移性被認為是基因組可塑性的一個重要機制和物種變異性的一個來源(Dobinson & Hamer,1993; Daboussii & Capy,1997)。因此，以上提到的重復因子在更好地研究菌株起源和它們的相互關系上顯得非常有用就不足為怪了。用Abr1、Tab1和Abr3作探針，在8個傳統(tǒng)栽培菌株中只見到兩種不同的基因型（圖3）。這兩種基因型與1980年以前使用的傳統(tǒng)栽培種的表型（白色與乳白色）相一致(Fritsche & Sonnenberg,1988)。這意味著用不同名稱進入市場的許多菌株在遺傳上非常相似。當用同樣的探針檢測現(xiàn)在的雜交種時獲得了可比的結果。在測試的9個商品菌株中只發(fā)現(xiàn)一種基因型（圖4）。大多數(shù)商業(yè)雜交種的來源是保持完好的秘密。而Horst U1的構建已被很好地證明(Fritsche,1983)。Horst U1是由白色菌株Somycel 53的培養(yǎng)物H39與乳白色菌株Somycel 9.2的培養(yǎng)物H97分離出的不育單孢雜交后獲得的。該雜交種上市后幾個月內便出現(xiàn)了其它雜交種。在表型上與第一個雜交種并不能區(qū)分的這些“新”雜交種的上市時間暗示了它們要么是第一個雜種的復制品，要么是其可育單孢分離物。在后一種情況中，表型保持不變并不足為怪，因為雙孢蘑菇典型的生活史趨向于在子代中保留親本的雜合性(Summerbell et al.,1989)。前期研究表明在白色和乳白色菌株中Abr1的多數(shù)拷貝在基因組中的定位是不同的(Sonnenberg et al.,1999)。Tab1基因組定位的檢測獲得了相似的結果（未發(fā)表）。這些差異最具爭論的解釋是轉座子已自主分布到每個菌株。換句話說，如果兩個菌株有一個共同的祖先，則兩種類型栽培種分離后已發(fā)生了轉座。由于近期沒有跡象表明兩個轉座子發(fā)生了轉座，這些結果暗示了兩種類型的栽培種并不緊密相關。當用Abr1、Tab1和Abr3作探針時，當今的棕色菌株也顯示了一致的帶型。然而這些帶型與白色或乳白色菌株中所見的帶型差異很大（圖3）這意味著傳統(tǒng)栽培種至少可細分為在遺傳上不相關的三種類型。因此，原先認為世界上所有的雙孢蘑菇傳統(tǒng)白色栽培種均來自1926年發(fā)生于奶油色蘑菇菇床上的那叢著名的“雪白”蘑菇(Lambert,1959; San Antonio,1984)的看法并不確切。

圖3 用重復因子作探針的傳統(tǒng)栽培種的指紋圖譜。A片：Abr3作探針的帶型。Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinden A4; 3:Somycel 9.2; 4:Le Lion B14; 5:Les Miz 66; 6:Les Miz Y217; 7:Somycel 53; 8:Amycel 2400; 9:Amycel 456; 10:Le Lion C9; 11:Royal 101; 12:Marker。B片：Abr1作探針的帶型。 Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinde A4; 3:Somycel 9.2; 4:Somycel 76; 5:Le Lion B14; 6:Les Miz 66; 7:Les Miz Y217; 8:Somycel 53; 9:Amycel 2400; 10:Amycel 456; 11:Le Lion C9; 12:Royal 101; 13:marker。三種類型栽培種表示為I：乳白色菌株，II：白色菌株，III：棕色菌株。

重復序列在野外收集菌株的基因分型中也非常有用。栽培種中見到的一致性和蘑菇屬種質工程(Kerrigan,1996)菌株中見到的高度可變性形成了對比。然而，當用Abr1和Tab1對野外收集物進行篩選時也發(fā)現(xiàn)了一些驚人的相似性。采集自鄰近地點的許多菌株顯示出相同或相似的圖譜表明了這些菌株間的無性繁殖關系。也發(fā)現(xiàn)有的圖譜與三種傳統(tǒng)栽培種之一相同，這可能代表“逃脫”的菌株或已被馴化的原始野生菌株。雙孢和四孢品種中Abr1拷貝數(shù)目的顯著差異也支持Abr1在系統(tǒng)發(fā)育研究中的有用性(Sonnenberg et al.,1999)。

用轉座因子作探針篩選ARP收集物時，偶然見到有的菌株根本沒有雜交信號。從ARP收集菌株得到的有效數(shù)據(jù)表明這些菌株可能代表不同于雙孢蘑菇的另一個種。因此我們檢測了好幾個蘑菇種和其它一些代表性食用菌的種中是否存在這四個重復因子（表1）。這些分析顯示所有因子在非蘑菇種中均不存在，且Abr1和Tab2只存在于雙孢蘑菇中。因此，從野外收集菌株中鑒定出雙孢蘑菇種質，這些重復因子是非常有用的。

圖4 用3個不同重復因子作探針的9個商品菌株的帶型。Lane 1:Amycel 2800; 2:Le Lion X8; 3:Somycel 608; 4:Horst U1; 5:Int.Spawn 643; 6:Sylvan 100; 7:marker; 8:Le Lion X22; 9:Le Lion X20; 10:Somycel 512。每個分析使用的探針標示在下方。

表1 重復因子在不同食用菌種中的出現(xiàn)

物種 Abr1 Abr3 Tab1* 　Tab2

大肥菇 －　　　?。　　　　馈　　　。?p> 野蘑菇　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 赭鱗蘑菇　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 球基蘑菇　　　　　　　　　　－　　　?。　　　。　　　。?p> 蘑菇　　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> Agaricus excellens　　　　　　 －　　　?。　　　　馈　　　。?p> 巨孢蘑菇　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 楊樹菇　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 側耳　　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> Stropharia rugoso annulata ?。　　　。　　　。　　　。?p> 毛頭鬼傘　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 紫丁香蘑　　　　　　　　　　－　　　?。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（白色）　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（乳白色）　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（棕色）　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> *± 弱雜交信號

7 數(shù)值標記和連鎖分析

標記可以通過它們的親本類型在子代中的遺傳而確定其在基因組的位置。一般來說，當標記被定位于同一條染色體上時，親本類型在超過50%的子代中被共同遺傳。當定位于不同的染色體上時，發(fā)現(xiàn)親本與非親本類型的比例為1:1。對分離數(shù)據(jù)的解釋或曲解的難度可以有許多理由。其一是親本類型的不均衡分離可能是由于子代中不存在某種遺傳組合。另外，當一對標記位于染色體相對的末端，重組頻率將可能接近于50%，與位于不同染色體上的一對標記類似。這些及其它模糊問題可以通過在完整分離的染色體上設定引物而得以解決。多數(shù)真菌染色體大小范圍在1-10Mb之間并可以通過脈沖場凝膠電泳完整地分開(Chu et al.,1986)。好幾個研究小組已解決了雙孢蘑菇的染色體問題(Royer et al.,1992; Lodder et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。Sonnenberg 等人（1996）已將組成Horst U1的兩個同核體分離為11條帶。多個DNA序列（探針）與包含完整染色體的膜雜交而應用于染色體研究。這些數(shù)據(jù)結合分離分析明確表明每個同核體的11條帶代表13條染色體。

由于連鎖分析是高效育種工程的基礎，遺傳標記的數(shù)值表示應該是快速而可靠的。同工酶標記和RFLP是非常強大的標記，在沒有圖譜數(shù)據(jù)可用時，它們實際上成了選擇標記(Spear et al.,1983; Kerrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。然而這些類型標記的檢測是耗時的。當用重復序列作探針時，可即時監(jiān)測許多位點的分離，雙孢蘑菇中已用到Abr1、Tab1和Abr3（將有進一步的說明）。以PCR為基礎的標記分析更是快速得多，特別是不需要任何序列數(shù)據(jù)的RAPD分析。而基于已知序列的PCR分析如前面提到的SCARS，則更為可靠。

圖5 以兩個不同的重復序列為引物組合獲得的PCR片段的帶型。用“P”標出的泳道代表親本類型，用“offspring”標出的泳道顯示條帶的分離。凝膠右邊的數(shù)字表示染色體，通過分離分析各個條帶可指定到相應的染色體上。

圖6 通過重復序列標記（RFLP或PCR）的分離分析構建的一個遺傳連鎖圖。以每條染色體上末端為起點的標記位置標在左側，標記名稱標在右側。

類似于由長度變化和微衛(wèi)星基因組位置引起的基因組變異的檢測（見第5節(jié)），前面論述的雙孢蘑菇中類轉座子序列可用于相同的途徑。人們發(fā)展了一種基于PCR的方法檢測包含一個Abr1拷貝的位點。結果顯示了在兩個傳統(tǒng)栽培種中，該遺傳因子在基因組上的定位是不同的。一個栽培種類型的Abr1兩側的一對引物在另一栽培種類型中產生較短的片段，原因是后者中Abr1的缺失。設計了包含轉座子Tab1區(qū)域的類似引物。另外，還設計了轉座子序列引物并用不同組合擴增相鄰轉座子之間的基因組區(qū)域。這看來已成為位點作圖的最有效的方法之一。圖5顯示用一個引物對（每個代表不同的重復序列）擴增一個栽培菌株和一個野生菌株的同核體及它們的同核子代的帶型。用該特異引物對，可立即標出6條染色體上的6個位點。結果清楚地體現(xiàn)了重復序列中作圖中的價值，圖6給出的遺傳圖證明了這一點（DRAWMAP軟件建圖，Stam,1993）。不管使用的是RFLP技術或PCR，該連鎖圖上的標記幾乎全部來自重復序列。不同染色體上標記密度的變化反應了重復序列在雙孢蘑菇基因組內的分布。不同重復序列與分離的完整染色體雜交結果顯示，特別是11號和12號染色體包括了Tab1和Abr3的許多拷貝，而9號染色體不包含任何已知的轉座子類似序列。該條染色體僅包含一個重復序列，體現(xiàn)于包含核糖體DNA基因的銜接排列的核糖體單元。因此，圖中所示9號染色體上的標記可能代表一個特殊的PCR片段。

該圖還顯示了兩個與PCR標記連鎖的重要表型，即位于1號染色體上的交配型和8號染色體上的菇蓋顏色。由于該圖中所用的子代來自一個商品菌株與野生菌株的雜交種，這些結果也表明了野生同核體有13條染色體。到目前為止我們研究過的其它野生同核體具有相同的染色體數(shù)目，包括四孢變種A.burnettii。這暗示著在雙孢蘑菇種內13條的染色體數(shù)目是一個標準。

8 與表型連鎖的標記

遺傳標記可以用來標出由某一位點決定的、通常以“是/否”方式表達的性狀，也可標出通常由更多基因決定的更為復雜的數(shù)量表達性狀(Lynch & Walsh,1998)。目前雙孢蘑菇中僅有有限數(shù)量的表型與遺傳標記連鎖，所有這些表型看起來主要由單一位點決定。最初的一個是交配型(Xu et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)，它被定位在最大的染色體即1號染色體上。雙孢與四孢蘑菇雜交種子代的分離分析表明同一條染色體也包含了擔孢子數(shù)目（BSN）的主要決定因子(Imbernon et al., 1996)。兩個表型在育種工程中均扮演著突出的角色。與交配型連鎖的標記在雙孢蘑菇對雙孢蘑菇次級同宗配合的同核體篩選中特別有用。包括交配型在內的所有位點在同核體中主要是以同點等位基因存在的。然而異核體子代由于重組產生的多個位點也可以是同點等位基因。一般來說，篩選生長緩慢的單孢分離物（SSI）可得到高比率的同核體(Fritsche,1984)。而在單孢分離物中預篩選生長緩慢者，再用交配型連鎖的標記進一步篩選同點等位基因，則獲得的幾乎所有的單孢分離物均是同核的(Kerrigan et al.,1992; Sonnenberg, 未發(fā)表)。同樣的標記在選擇用于回交或與其它菌株交配的合適的交配型等位基因方面也是有用的。與擔孢子數(shù)目連鎖的標記可用于向商品菌株引入遠系的性狀。四孢擔子的出現(xiàn)將加快同核單孢分離物的分離。發(fā)現(xiàn)的另一個重要表型的遺傳標記是菇蓋顏色或稱pilei-pellis顏色(Loftus et al.,1995及本論文集,Callac et al.,1998; Sonnenberg,本文)。

要發(fā)現(xiàn)其它重要性狀如產量、質量及抗病性的標記將更加困難。這些性狀通常是數(shù)量遺傳并且象是由多基因決定。另外，由于同時產生的遺傳和環(huán)境的影響，對這些性狀的評估是困難的。在雙孢蘑菇野生菌株中已發(fā)現(xiàn)對細菌性斑點病(Olivier et al.,1997)和干泡病(Dragt et al.,1995)的抗性或低敏感性。在評估托拉斯假單胞桿菌(Olivier et al.,1997)和真菌寄生輪枝菌(Mamoun & Olivier, 1995)的感染方面已取得一些進展，但仍缺乏滿意的數(shù)量表示方法?？芍貜偷牧炕椒ㄊ前l(fā)現(xiàn)與這些性狀連鎖的遺傳標記的前提。

在一批來自栽培種與野生種的雜交菌株的子代中，我們測量了第一個菇蕾形成的時間以及兩個菇潮的平均菇柄長度。應用MapQTLTM軟件(Van Ooijen & Malienaard,1996)發(fā)現(xiàn)了與這些性狀（LOD3.0）顯著連鎖的染色體區(qū)域，表明原則上可以發(fā)現(xiàn)數(shù)量性狀的標記。

繼核DNA編碼的性狀作圖之后，重點要指向作為基因組變異的一個來源的線粒體基因組。De la Bastide等人（1997）為線粒體DNA序列和核-線粒體相互作用對雙孢蘑菇生長的影響提供了證據(jù)。把線粒體基因組包括到育種工程中應該不難，因為雙孢蘑菇野生種群的線粒體DNA中存在廣泛的變異(Xu et al.,1998)，并且雜交和去異核化會產生許多核-線粒體組合體(Khush et al.,1995; Sonnenberg et al.,1995)。

9 遺傳轉化

繼經典育種之后，選擇性標記的改進，使得一項新技術在育種中已變得實用，即遺傳轉化。該技術通過引入其它菌株或其它物種的DNA序列、基因組整合并表達使菌株的遺傳改變。該技術已在植物、動物和真菌的育種中完全實現(xiàn)，但直到現(xiàn)在，該技術在雙孢蘑菇中仍不實用。關于雙孢蘑菇遺傳轉化的第一個報告可追溯到1996年(Van de Rhee et al.,1996)。在這兒潮霉素抗性被引入作為轉化細胞的選擇標記。結合在一個廣泛使用的質粒上的標記用標準技術導入原生質體。然而其它實驗室到目前為止仍無法重復該轉化系統(tǒng)(Van de Lende & Wessels, Challen, Mikosch,個人通信)。最近，原先為植物細胞轉化設計的農桿菌轉化系統(tǒng)被應用到雙孢蘑菇和許多其它真菌的轉化中(De Groot et al.,1998)。該系統(tǒng)在其它實驗室看來也可轉化。Mikosch等人（本論文集）已能進一步優(yōu)化該技術，使之成為轉化雙孢蘑菇無性菌絲體的有效方法，從而使商品菌株的遺傳改變具有可能性。

遺傳工程食品在消費者中暫時并不流行。但系統(tǒng)本身是基因功能研究的一個不可缺少的工具。它允許序列在基因組中有目的的整合，也因此可造成被選擇基因的中斷。對已知表型的繼后研究可闡明各自基因的功能。該基因工程工具也為工業(yè)或醫(yī)藥用途的非食品成份的生產菌株的構建提供了前景。額外的作用是能擴大食用菌產品市場，因為消費者對遺傳改變在非食品目的上的應用一般反應較為平淡。

10 總結性評論

以上提供的信息表明雙孢蘑菇新菌株開發(fā)的前提條件均已得到滿足。生活史已知且允許育種。多樣化的野生收集菌株是有用的，其中已發(fā)現(xiàn)許多令人感興趣的特性。最后，育種新技術的開發(fā)已取得重要進展，特別是遺傳標記的發(fā)展與檢測。食用菌業(yè)中的許多人常常提出這樣的問題：新菌株何時問世？為什么要花這么長時間？我希望本篇綜述已講清楚這一點，即直到最近，產生新菌株的所有前提條件才得到滿足。Fritsche推出第一個雜交種時邁出的重要一步是不容易重復的。她用傳統(tǒng)栽培種制造新菌株(Fritsche,1986)，這些栽培種得到了許多在育種過程中被明顯保留下來的優(yōu)良性狀。然而，許多有意義的性狀栽培種中不存在，卻在毫無商業(yè)價值的野外收集菌株中發(fā)現(xiàn)。雖然標記技術顯著加快育種的進程，但要把一個特殊性狀轉移到當今商品栽培種中也是一項耗時的工作。一般觀點認為我們現(xiàn)在離新菌株的誕生為期不遠了。作這種聲明需要一定的慎重，因為經驗表明,“不久將出現(xiàn)”的承諾與市場上實際出現(xiàn)之間可能還有一段時間(Loftus et al.,1995)。

11 致謝

本工作由Bromyc和海牙園藝產品局提供部分支持。我想特別感謝Jose in ‘t Zandt-Linders和Karen den Hollander女士的技術幫助及L.J.L.D.van Griensven和J.J.P.Baars的有幫助的評論性意見。

參考文獻（略）