雙孢蘑菇A41基因組文庫的構(gòu)建及篩選

陳美元 王澤生 廖劍華 郭仲杰 盧政輝 李洪榮

(福建省輕工業(yè)研究所，福州，350005)

摘要：雙孢蘑菇叢生菌株A41基因組DNA用Sau3AI部分酶切后克隆到EMBL3載體中，構(gòu)建了該菌株的基因組文庫，其滴度為2.2×105pfu/ml，插入片段平均長度為12.6Kb。用地高辛標(biāo)記的DLDH(二氫硫辛酰胺脫氫酶)基因探針對該文庫進行篩選并獲得一陽性克隆，經(jīng)鑒定其插入片段約8.5Kb。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇，基因組文庫，構(gòu)建，篩選，DLDH

雙孢蘑菇具有重要的經(jīng)濟價值和很高的營養(yǎng)價值，被譽為二十一世紀(jì)的健康食品，國際年產(chǎn)量達到300多萬噸，是世界上最大宗的食用菌，對它的研究最多，其育種也已深入到分子水平。近年來，國內(nèi)外對雙孢蘑菇分子遺傳學(xué)方面的研究有了較顯著的進展[1]，成果主要集中在遺傳標(biāo)記、重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子、系統(tǒng)發(fā)育、連鎖分析、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化等方面。就國內(nèi)而言，本所發(fā)現(xiàn)了與菌株產(chǎn)質(zhì)量性狀相關(guān)的同工酶和RAPD標(biāo)記[2，3]，克隆了與叢生變異相關(guān)的DNA片段[4]，并對國內(nèi)種植最廣的AS2796進行了家系的分子遺傳分析[5]；廈門大學(xué)與我所合作克隆了一個質(zhì)量相關(guān)DNA片段與幾個耐熱相關(guān)的基因片段[6，7]?？偟膩碚f，國內(nèi)外對應(yīng)用基因工程技術(shù)改良蘑菇品種特性進行了十多年的探索，在理論與技術(shù)上都取得了顯著的進展，已轉(zhuǎn)入有針對性的改良品種的應(yīng)用研究，預(yù)計數(shù)年之后，蘑菇轉(zhuǎn)基因的品種就可以問世，造福于人類。

基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體[8]，完整的基因組文庫的構(gòu)建使任何DNA片段的篩選和獲得成為可能，這是人們對生物體基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達及其調(diào)控進行深入研究的基礎(chǔ)。通過篩選基因組文庫或cDNA文庫獲得完整的基因，是應(yīng)用基因工程手段改良品種的一個重要步驟，而其前提條件就是構(gòu)建完整的基因文庫(包括基因組文庫和cDNA文庫)。

1 材料與方法

1.1 菌株：雙孢蘑菇叢生菌株A41由美國Sylvan公司提供，現(xiàn)保存于福建省蘑菇菌種研究推廣站。

1.2 試劑：基因組克隆與包裝試劑盒購自美國Promega公司，地高辛標(biāo)記與檢測試劑盒、尼龍膜購自德國BOEHRINGER MANNHEIM公司，DNA純化試劑盒、Sau3AI、SalI、T4 DNA Ligase、RNaseA、DNaseI及其它試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 基因組DNA提?。喊碨ylvan公司提供的方法并加以改進。10克新鮮菇蓋組織置濾

紙中擠干水分，加液氮磨碎，粉末移入15ml預(yù)冷的抽提緩沖液(100mM Tris-Cl, pH8.0; 50mM EDTA; 500mM NaCl; 20mM NaHSO3)中，旋渦振蕩。加入2ml 10% SDS，充分混合，在65℃保溫15min，加入5ml 5M KOAc，再次混合均勻，冰上放置20min。13000g離心20min后，上清通過兩層紗布濾入10ml異丙醇中，沉淀的核酸用消毒玻棒纏繞出來，70%乙醇洗一次，空氣中稍加干燥后于2ml TE(50mM Tris-Cl, pH8.0; 10mM EDTA; 25ug/ml RNaseA)中溶解過夜，酚/氯仿抽提一次，用0.1V 2.5M NaOAc(pH7.0)和0.7V異丙醇再次沉淀。最終的DNA懸浮于100ul TE中，4℃保存。

1.4 部分酶切及其產(chǎn)物純化：200ul反應(yīng)體系中含約20ug基因組DNA，0.1U Sau3AI，混勻后分裝到10個小管中，于37℃水浴中保溫，每隔5min取出一管加EDTA至終濃度10mM終止反應(yīng)，最后用0.4%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓2V/cm)檢測其部分酶切效果，并據(jù)此進行大量酶切，酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒直接純化。

1.5 基因組文庫的構(gòu)建：按照基因組克隆與包裝試劑盒說明書進行。包括以下步驟：(1)部分酶切產(chǎn)物與載體EMBL3/BamHI Arms用T4 DNA Ligase進行連接；(2)連接產(chǎn)物與包裝提取物進行體外包裝；(3)包裝產(chǎn)物梯度稀釋后侵染感受態(tài)E.coli KW251；(4)鋪平板培養(yǎng)進行文庫的滴度測定。

1.6 基因組文庫的擴增：按文獻[9]的方法進行。

1.7 基因組文庫的篩選：文庫噬菌體稀釋培養(yǎng)、噬菌斑影印到尼龍膜以及隨后的變性及固定處理按照基因組克隆與包裝試劑盒說明書進行。尼龍膜與地高辛標(biāo)記探針的雜交及顯色按照地高辛標(biāo)記與檢測試劑盒說明書進行。噬菌體DNA的提取按文獻[9]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取：紫外分光測得總DNA的OD260/OD280約為1.5-1.6，說明還含有一些多糖等雜質(zhì)。電泳圖譜顯示其質(zhì)量良好，大部分DNA分子長度均達50Kb左右(圖1)，其濃度估計為1ug/ul。

2.2 2.2 部分酶切及產(chǎn)物純化：發(fā)現(xiàn)200ul反應(yīng)體系中含約20ug基因組DNA，0.1U Sau3AI，37℃酶解15min時，可獲得最佳的部分酶切效果，其20Kb DNA片段的比例較高(圖1)。據(jù)此條件進行大規(guī)模酶解，酶解產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進行純化，并洗脫于適當(dāng)體積的純水中，使其終濃度約0.5ug/ul。

M 1 2 3 4 5

圖1 A41基因組DNA部分酶切產(chǎn)物在0.4%瓊脂糖凝膠上電泳分離圖譜

Fig1 Patterns of partially digested genomic DNA of A41 separated on 0.4% Agarose gel

M道:λDNA Mix 19 Marker, 1道:無酶對照,2-5道:25,20,15, 10min部分酶解產(chǎn)物

Lane M:λDNA Mix 19 Marker, Lane 1:non-enzyme CK, Lane 2-5: Partially digested product of 25,20,15,10min, respectively

2.3 基因組文庫的構(gòu)建：純化的部分酶切產(chǎn)物經(jīng)連接、包裝后，每60ul包裝產(chǎn)物加入445ul 噬菌體稀釋緩沖液，25ul 氯仿，5ul 1% 明膠，35ul DMSO，混勻后4℃保存。作103，104，105梯度稀釋后鋪平板測定滴度，得其平均滴度為2.2×105pfu/ml。隨機提取4個噬菌斑DNA，用SalI進行酶切分析，其插入片段長度分別為8.5,8.9,13.0,20.0Kb，故該文庫的平均插入片段長度為12.6Kb。由于雙孢蘑菇基因組總長只有34Mb，根據(jù)公式N=ln(1-p)/ln(1-f)[10](其中p是希望得到該段DNA的機率，f是插入片段長度與基因組總長度的比值)，按插入片段12Kb，獲得某基因片段機率99%計算，其基因文庫所需重組噬菌體只要1.3×104個，所以即使考慮內(nèi)切酶酶切位點的非隨機性，我們所建的文庫也應(yīng)該是完整的。

2.4 基因組文庫的篩選：使用735bp地高辛標(biāo)記的DLDH基因(該基因已被證明可能與雙孢蘑菇的叢生變異有關(guān)[4])探針對擴增后的文庫進行篩選，從1500個噬菌斑中獲得1個陽性克隆(圖2)。挑取該克隆稀釋后鋪平板作進一步的雜交鑒定，所有噬斑均有雜交信號，證明其確為陽性克隆(圖3)。提取該克隆的重組DNA，用SalI進行完全酶切，電泳結(jié)果顯示該重組DNA被切為20.0, 9.0, 8.5Kb三條帶(圖4)，其中前二者分別為EMBL3載體的左右臂，而插入片段為8.5Kb。

圖2 DLDH基因探針與A41基因組文庫的雜交圖譜 圖3 DLDH基因探針與陽性克隆的雜交圖譜

Fig2 Hybridization pattern of A41 genomic library with Fig3 Hybridization pattern of the positive clone

the probe of DLDH gene with the probe of DLDH gene

1 2 M

　　　　　圖4 陽性克隆重組DNA的SalI酶切圖譜

　　　　　Fig4 Band pattern of the recombinant DNA of the positive clone by SalI digestion　

　　　　　M道：λDNA/HindIII Marker，1道：重組DNA，2道：重組DNA/SalI

　9.4Kb　 Lane M:λDNA/HindIII Marker, Lane 1:Recombinant DNA, Lane 2:

　6.6Kb　　　　　Recombinant DNA/SalI

3 討論

一般真核生物基因組文庫所要求的DNA插入片段長度為17-20Kb，這個長度包含完整真核基因的可能性較大。但這樣對基因組DNA的質(zhì)量要求較高，長度最好要達到80Kb以上。由于一些實驗條件的限制，我們所采用的方法未能獲得更高質(zhì)量的基因組DNA，部分酶切后獲得的帶兩個粘末端的20Kb DNA片段的比例較低，故純化的20Kb片段經(jīng)連接包裝后難以獲得滿意的滴度。為得到較高滴度，我們直接純化了20Kb片段比例較高的部分酶切產(chǎn)物，讓EMBL3載體的包裝范圍(9-23Kb)對片段進行選擇，最終構(gòu)建了一個平均插入片段長度為12.6Kb的雙孢蘑菇基因組文庫。

DLDH在線粒體呼吸中起著非常重要的作用，我們的前期研究表明它可能與雙孢蘑菇的叢生變異有關(guān)。通過DLDH基因片段探針的雜交篩選，我們獲得了一個8.5Kb的DNA片段。在以后的研究中，我們希望通過篩選該文庫能夠獲得完整的DLDH基因，進一步研究其與正常菌株的該基因是否存在差異，以確證它與叢生變異的相關(guān)性。

參考文獻

1 A.S.M.Sonnenberg, 2000, Genetics and breeding of Agaricus bisporus, Mushroom Science, 15(1):25-39.

2 H.C.Wang et.al.,1989,The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis,Mushroom Science, 12(1):87-100.

3 陳美元，廖劍華，王澤生，1998，雙孢蘑菇三種類型菌株的RAPD擴增研究，食用菌學(xué)報，5(4):6-10。

4 Zesheng Wang, Meiyuan Chen & Jianhua Liao, A Preliminary Study on the Molecular Mechanism of Clustering Variation of Agaricus bisporus, 2000, Proceedings of 1st Meeting for Fareast Asia Cooperation on Edible Fungi, Shanghai, China.

5 王澤生，廖劍華，陳美元等，2001，雙孢蘑菇雜交菌株AS2796家系的分子遺傳研究，菌物系統(tǒng)，20(2)：233-237。

6 曾偉，宋思揚，王澤生等，1999，雙孢蘑菇及大肥菇的種內(nèi)及種間多態(tài)性RAPD分析，菌物系統(tǒng)，18(1)：55-60。

7 宋思揚，陳蘭芬，鄭忠輝等，2001，雙孢蘑菇耐溫相關(guān)基因片段的分析，待發(fā)表。

8 盧圣棟主編，1999，現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)(第二版)，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，北京，P295。

9 J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著(金冬雁，黎孟楓等譯)，1992，分子克隆實驗指南(第二版)，科學(xué)出版社，北京，P160-161，P473。

10 魏群主編，1999，分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)，高等教育出版社，北京，P21。

Construction and Screening of the Genomic

Library of Agaricus bisporus A41

Meiyuan Chen Zesheng Wang Jianhua Liao Zhongjie Guo Zhenghui Lu Hongrong Li

(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005, P.R.China)

Abstract: The genomic DNA of the clustered strain A41 of A.bisporus was partially digested by Sau3AI and cloned into the vector EMBL3, and the genomic library of this strain was constructed with a titer of 2.2×105pfu/ml and an average size of 12.6Kb of the insert DNA. The library was screened with the Dig-labeled probe of DLDH (dihydrolipoamide dehydrogenase) gene and a positive clone with an insert DNA of 8.5Kb was obtained.

Keywords: Agaricus bisporus, Genomic library, Construction, Screening, DLDH